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오메가-3 다중불포화지방산(n3-PUFA)은 항염 효과가 있는 것으로 알려져 있으며 근육감소증의 맥락에서 유익할 수 있습니다. 우리는 노인의 근육 미토콘드리아 생리학과 단백질 대사에 대한 n3-PUFA의 영향을 결정했습니다. 12명의 젊은(18-35세) 및 노년(65-85세) 남녀가 기준선에서 연구되었습니다. 노년층은 n3-PUFA 보충(3.9g/일, 16주) 후에 다시 연구되었습니다. 근육 생체검사를 사용하여 분리된 미토콘드리아에서 호흡 능력(고분해능 호흡 측정법)과 산화제 방출(분광 형광 측정법)을 평가했습니다. 최대 호흡은 젊은이에 비해 노년층에서 유의하게 낮았습니다. n3-PUFA는 호흡을 변화시키지 않았지만 산화제 방출을 유의하게 감소시켰습니다. 참가자들은 저항 운동을 한 번 한 다음 운동 후 15시간과 18시간에 생체검사를 실시했습니다. 근육 단백질 회전율에 관여하는 여러 유전자는 기준선과 운동 후에 노인에서 상당히 변화했지만, 근육 단백질 합성은 두 조건에서 연령대 간에 유사했습니다. n3-PUFA 보충 후, 혼합 근육, 미토콘드리아 및 근육질 단백질 합성률은 운동 전 노인에서 증가했습니다. n3-PUFA는 노인에서 운동 후 미토콘드리아 및 근원섬유 단백질 합성을 증가시켰습니다. 이러한 결과는 n3-PUFA가 미토콘드리아 산화제 배출을 감소시키고, 흡수 후 근육 단백질 합성을 증가시키고, 노인에서 운동에 대한 동화 반응을 향상시킨다는 것을 보여줍니다.
소개
골격근은 수명 동안 신체 기능, 건강 및 삶의 질에 중요하지만, 근육량과 근력은 노년층에서 명백히 손상되며[ 1 ], 특히 60대 이후에 손상 됩니다[ 2 ]. 근육감소증은 노년층의 신체 기능 저하에 기여하는 주요 요인이며, 미래 장애를 예측합니다[ 3 ]. 근육감소증은 다요인적 원인을 가지고 있으며, 건강수명에 미치는 부정적인 영향은 전신 최대 산소 섭취량(VO2 피크) 감소 [ 4 ] , 신경퇴행성 변화, 비만 증가[ 5 , 6 ], 근육 줄기 세포 틈새의 재생 잠재력 감소[ 7 , 8 ], 미토콘드리아 생리학 변화[ 9-12 ]를 포함한 다른 관련 노화 특징으로 인해 더욱 악화됩니다.
운동은 근육량과 근력의 개선[ 14 ], 근육 단백질 합성 속도 증가[ 15 , 16 ], 미토콘드리아 증식 [ 17 , 18 ], 산화 능력 증가[ 10 ], 위성 세포 함량 증가 [ 19 ]를 포함하는 다중적 적응을 통해 근육감소증과 관련 합병증을 예방하고 역전 시키는 것으로 입증된 치료 전략입니다. 그러나 많은 경우 이러한 적응은 둔화되고, 발생이 더 느리며 노인의 운동 후에 더 빨리 사라집니다[ 15, 18, 20, 21 ] . 예 를 들어 , 노인은 저항 운동 훈련에 대한 비대 반응이 둔화되고[ 22 , 23 ], 저항 운동의 급성 발작에 대한 근육 단백질 합성 증가가 약화 됩니다 [ 24-26 ] . 이러한 관찰 결과는 노화에 따른 동화작용 저항 개념[ 27 ]과 일치하며, 이는 부분적으로 노화와 함께 종종 관찰되는 만성적이고 저급의 무균성 염증[ 28 , 29 ]에 의해 유발되고 허약함과 관련이 있는 것으로 보입니다[ 30 ]. 종양괴사인자 ɑ(TNFɑ)와 같은 염증성 사이토카인은 mRNA 번역 효율을 감소시켜 근육 단백질 합성을 억제하는 것으로 알려져 있습니다[ 31 ]. 또한 TNFɑ 발현은 허약한 노인의 근육 단백질 합성과 반비례했습니다[ 32 ]. 마찬가지로 Toth 등은 흡수 후 근육 단백질 합성률이 젊은 성인에 비해 노인에서 20% 낮았고 순환 C-반응성 단백질, 인터루킨-6 및 TNFɑ 수용체 II와 반비례했음을 보여주었습니다[ 33 ]. 이러한 연구를 종합하면 염증이 노인의 동화작용 반응을 약화시킬 수 있음을 시사합니다. 이 가설을 더욱 뒷받침하는 것은 비스테로이드성 항염제나 오메가-3 다중불포화지방산을 사용하여 염증을 감소시킨 연구에서 나왔습니다. 이러한 개입은 노화에 따라 단백질 합성률을 회복시켰고[ 34 , 35 ] 노인의 저항 운동에 대한 반응으로 근육량과 근력 증가를 증진시켰습니다 [ 36-38 ] .
노화된 골격근에서 관찰되는 미토콘드리아 이상(산화 스트레스 증가[ 39 ], 미토콘드리아 산화 능력 감소[ 12 ], 풍부함[ 12 ], 미토콘드리아 단백질 발현 감소[ 10 ]로 인한 미토콘드리아 기능 장애)과 만성 염증을 연결하는 확실한 증거도 있습니다. TNFɑ 및 IL-1β와 같은 염증 매개체는 활성 산소종(ROS) 생성을 유도하고 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체의 활성을 변경하는 것으로 나타났습니다[ 40 ]. 최근 식이 오메가-3 다중불포화 지방산(n3-PUFA)이 인간의 지방 조직 염증을 감소시키고[ 41 ] 마우스에서 TNFɑ 신호 전달 경로를 억제한다는[ 42 ] 보고에 비추어 , 저희는 최근 식이 n3-PUFA가 노화 마우스에서 근육 미토콘드리아 기능을 회복시킬 수 있는지 확인했습니다[ 43 ]. 우리는 에이코사펜타엔산의 항염 효과가 미토콘드리아 생합성의 상향 조절된 전사 조절자[ 44 ]와 노령 마우스의 미토콘드리아 기능의 현저한 개선과 관련이 있다고 보고했습니다[ 43 ]. 노령 인간의 만성 염증을 억제하기 위한 유사한 영양 전략이 운동에 대한 동화작용 반응을 개선할지 아니면 설치류에서 관찰된 근육 미토콘드리아 기능의 개선을 재현할지는 아직 불분명합니다.
현재 연구에서 우리는 건강한 노인의 근육 미토콘드리아 생리학, 골격근 단백질 합성 및 급성 운동에 대한 동화 반응에 대한 식이 n3-PUFA의 영향을 결정함으로써 쥐의 초기 관찰 결과를 인간의 노화로 전환하고자 했습니다. 12명의 건강한 젊은(18-35세) 및 노인(65-85세) 남녀가 기준선에서 연구되었습니다. 노인은 3.9g/일의 n3-PUFA 보충에 대한 16주간 개방형 개입 후에 다시 연구되었습니다. 골격근 생체검사는 미토콘드리아 호흡 및 ROS 생성, 흡수 후 근육 단백질 합성 속도 및 급성 운동에 대한 동화 반응을 포함한 주요 결과를 평가하기 위해 수행되었습니다(그림(그림11).
결과
젊은 성인과 노년 성인의 기술적 특성(n3-PUFA 보충 전후)은 표에 나와 있습니다.표1;1; 표의 생화학적 및 대사적 매개변수표2,2, 그리고 표의 플라스마 유리지방산 프로필표33.
노령 성인의 미토콘드리아 기능 장애에 대한 증거
미토콘드리아는 흡수 후 조건에서 vastus lateralis 근육 생체검사 에서 분리되었으며 , 산소 소비량은 탄수화물 기반 호흡을 지원하는 기질을 사용하여 단계적 적정 프로토콜 동안 측정되었습니다(그림2A, 씨) 또는 지질 기반 호흡(그림2B, 디). 이 실험은 조직 무게에 비해 표현될 때 젊은 성인에 비해 노인의 근육에서 산소 소비율이 상당히 낮다는 것을 보여주었습니다(그림2A, 비) 또는 미토콘드리아 단백질 풍부도에 대한 상대적 값(그림)2씨, 디). 상태 3 호흡의 30-40% 감소는 호흡이 복합 I 전자 흐름을 통해 지원되었을 때 주로 분명했지만 호흡이 복합 II를 통해서만 지원되었을 때 상태 3 호흡에는 유의미한 차이가 없었습니다. 중요한 점은 산소 유량이 미토콘드리아 단백질 함량으로 정규화되었을 때 상태 3 호흡의 연령 관련 감소가 지속되었다는 것입니다(그림2씨, 디), 미토콘드리아 풍부도의 연령 관련 감소가 노인의 미토콘드리아 산화 능력 손실을 완전히 설명할 수 없음을 나타냅니다. 데이터는 세포소기관 수준에서 미토콘드리아 용량의 본질적인 손실을 나타냅니다. 미토콘드리아 호흡 용량이 상당히 감소했음에도 불구하고 젊은 성인과 노인은 서로 다른 에너지 상태에서 암플렉스 적색 산화의 형광 기반 모니터링을 통해 측정한 분리된 미토콘드리아에서 유사한 과산화수소(H 2 O 2 ) 방출 속도를 보였습니다(그림2E, F). H 2 O 2 가 조직 무게에 대해 표현되었는지 여부에 관계없이 (그림(그림2E)2이전) 또는 미토콘드리아 단백질 함량(그림(그림2F),2층), 노령자의 미토콘드리아에서 ROS 생산이 증가했다는 증거는 없었습니다.
n3-PUFA는 미토콘드리아 호흡을 증가시키지 않지만 노인의 미토콘드리아 ROS 생성을 감소시킵니다.
고령자에게 16주간 고용량(3.9g/일) n3-PUFA를 투여한 경우 탄수화물 기반 기질을 사용한 관찰 실험 조건에서 근육 미토콘드리아 호흡 속도가 크게 변화하지 않았습니다(그림2A, 씨). 지질 기질을 사용한 상태 2 및 상태 4 호흡은 n3-PUFA에 따라 상당히 낮았습니다(그림(그림2B),2B), 이러한 차이점은 미토콘드리아 단백질 함량으로 정규화되면 지속되지 않았습니다(그림(그림2D),2차원), 개입 후 상태 3 또는 완전히 분리된 호흡에 변화가 없었습니다. n3-PUFA 소비 4개월 후, 미토콘드리아의 ROS 방출 잠재력이 가장 높은 조건(상태 2, 상태 4)에서 미토콘드리아 H 2 O 2 생성이 20-25% 감소했습니다. ROS 생성의 이러한 감소는 속도가 조직 무게에 대한 비율로 표현되었을 때 분명했습니다(그림(그림2E)2이전) 또는 미토콘드리아 단백질 함량에 대한 상대값(그림)(그림2F).2층). 미토콘드리아 단백질로 정상화해도 ROS 생성 감소가 사라지지 않는다는 관찰 결과는 n3-PUFA가 내재적인 미토콘드리아 ROS 생성을 감소시킨다는 것을 시사합니다.
노령자의 둔화된 운동 반응성에 대한 전사 증거
젊은 성인과 노인은 익숙하지 않은 저항 운동(8세트, 1회 최대 중량의 70%에서 10회 반복)을 한 번 수행했습니다. 근육 생체검사는 운동 전과 운동 후 15시간에 수집하여 RT-PCR을 통해 근육 단백질 대사에 관여하는 선택된 표준 유전자의 발현을 측정했습니다(그림(그림 3).3). 근육 성장 및 발달의 부정적 조절자인 미오스타틴(MSTN)은 젊은 성인의 경우 운동 후 감소했지만 노인의 경우 감소하지 않았습니다(그림(그림 3A).3A). 마찬가지로 운동에 반응하여 근육 분화를 긍정적으로 조절하는 MyoD는 운동 후 젊은이에서는 상당히 증가했지만 노인에서는 그렇지 않았습니다(그림(그림 3B).3B). 근육 RING Finger 1로 알려진 E3 유비퀴틴 리가제를 인코딩하는 TRIM63은 젊은 성인의 운동 후 현저하게 감소했지만 노인의 경우에는 그렇지 않았습니다(그림(그림 3D).3D). 또 다른 유비퀴틴 리가제인 FBXO32는 젊은이의 운동 후 강력하게 증가했지만 노인의 경우는 그렇지 않았습니다(그림(그림3F).3층). 칼페인 1 및 2, 칼슘 활성화 중성 프로테아제는 감소했습니다(CAPN1, 그림그림3H)3시간) 또는 증가(CAPN2, 그림그림3I)3나) 젊은이의 운동 후 감소했지만 노인의 운동 후 감소하지 않았습니다. 세포 사멸을 유발하는 전사 인자인 FOXO3는 젊은이와 노인 모두에서 운동으로 인해 유사하게 감소했습니다(그림(그림 3G).3세대). 근육 단백질 회전을 조절하는 데 관여하는 여러 유전자의 mRNA 발현을 종합해 보면, 젊은이에 비해 노인의 운동에 대한 반응 변화가 약화되어 있습니다. 주목할 점은, 이러한 유전자(MSTN, FST, TRIM63, SLN, FBXO32, CAPN1, CAPN2) 중 많은 유전자의 기준선과 운동 전 발현에 연령 차이가 있었으며, 이는 운동 전 노인의 근육에서 활성 회전 상태와 일치합니다.
근육 단백질 합성의 생체 내 측정 결과 젊은이와 노인 모두에서 유사한 동화작용 반응이 나타났습니다.
골격근 단백질 합성률은 동위원소 표지된 페닐알라닌([고리-13 C 6 ] 페닐알라닌)을 정맥 투여한 후 질량 분석법으로 표지된 아미노산이 근육 단백질 풀에 통합되는 속도를 측정하여 측정했습니다. 혼합 근육 풀에서 측정했을 때 기준선 흡수 후 분획 합성률(FSR)은 젊은 성인과 노인에서 유사했습니다(그림(그림4A),4A), 미토콘드리아 분획(그림(그림4B),4B), 근육질 분획(그림(그림4C),4씨), 그리고 근원섬유 분획(그림(그림 4D).4D). 저항 운동의 단일 발작 후 15-18시간 후에 단백질 합성을 다시 측정하여 앞서 언급한 유전자 발현이 나이에 따라 변하는 것이 동화작용 저항(즉, 근육 단백질의 전환 속도)의 직접적인 증거와 함께 나타나는지 확인했습니다. 혼합 근육 FSR은 젊은 성인의 운동 후 상당히 증가했습니다(그림(그림4A).4A). 운동에 따른 혼합 근육 FSR의 증가가 노년층에서 통계적으로 유의미한 수준에 도달하지 않았지만, 젊은이와 노년층에서 휴식 시와 운동 후 FSR의 변화를 비교했을 때 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다(그림(그림4E).4E). 미토콘드리아 및 근육질 FSR은 운동 후 노년층에서 유의하게 증가했지만 젊은 성인에서는 그렇지 않았습니다(그림4B, 씨) 그러나 휴식에서 운동 후 FSR의 변화에는 차이가 없었습니다(그림4층, G). 혼합 근육 FSR과 유사하게 근원섬유 FSR은 젊은 성인에서는 운동 후에 상당히 증가했지만 노년 성인에서는 그렇지 않았습니다(그림(그림4D),4D), 그러나 우리는 젊은이와 노인의 휴식에서 운동 후 FSR의 변화를 비교했을 때 의미 있는 차이를 관찰하지 못했습니다(그림(그림4H).4시간). 전반적으로 혼합 근육 FSR과 세포 내 분획의 기준선과 운동 후 측정 결과는 흡수 후 근육 단백질 합성이나 동화 반응에 연령 관련 손상이 나타나지 않았다는 것을 보여줍니다.
n3-PUFA는 노인의 운동에 대한 흡수 후 단백질 합성과 동화 반응을 증가시킵니다.
흡수 후 및 운동 후 근육 단백질 합성 측정은 16주간 n3-PUFA를 매일 보충(3.9g/일)한 후 노인에서 반복되었습니다. 흡수 후 미토콘드리아(그림(그림4B)4B) 및 근육질(그림(그림4C)4씨) n3-PUFA 보충 후 노인의 단백질 합성. 혼합 근육의 경우에도 작지만 유의하지 않은 증가가 관찰되었습니다(그림(그림4A)4A) 및 근원섬유(그림(그림4D)4D) 기저 조건에서 분획. 운동 후, 미토콘드리아 및 근원섬유 분획의 FSR은 흡수 후 FSR보다 유의하게 높았습니다(그림4B, 디) 통계적 유의성에 도달하지 못한 MMP 및 근육질 분획의 증가와 함께. 각 분획의 FSR에서 운동으로 인한 증가는 n3-PUFA 개입 전후의 노인에서 쌍으로 비교되었습니다(그림4. E, F, G, H). 일부 개인은 운동으로 자극된 단백질 합성에서 강력한 증가를 보인 반면 다른 개인은 거의 개선되지 않았다는 것을 보여주는 개별 데이터 포인트에서 나타난 바와 같이 반응에 상당한 이질성이 있었습니다. 운동으로 자극된 미토콘드리아 FSR의 증가는 젊은이에 비해 n3-PUFA 보충 후 노인에서 유의하게 더 컸습니다(그림(그림4F).4층). 유사한 경향(P=0.07)이 근원세포 FSR(그림)에 대해서도 관찰되었습니다.(그림4H).4시간). 혼합 근육 및 근육질 분획에서 n3-PUFA는 운동으로 인해 일부 개인에서만 단백질 합성이 촉진되었으며, 다른 개인은 개입 전 값과 비교했을 때 변화가 없거나 감소한 것으로 나타났습니다(그림4A, 씨).
골격근 전체 전사체 시퀀싱
노화, 운동 및 n3-PUFA가 골격근 기능에 미치는 영향에 대한 기전적 통찰력을 얻기 위해 운동 전과 운동 후 15시간에 수집한 근육 생검 표본에서 추출한 RNA를 사용하여 차세대 시퀀싱을 수행했습니다. 총 834개의 유전자가 흡수 후 상태에서 기준선에서 젊은 사람과 노인 사이에서 유의미하게 달랐습니다(그림(그림5A).5A). 이들 유전자 중 39개는 미토콘드리아 관련 유전자로 분류되었습니다(14개는 연령에 따라 상향 조절되고 25개는 연령에 따라 하향 조절됨). n3-PUFA 개입 전후의 노인의 흡수 후 생체 검사 비교(그림(그림5B)5B)은 총 63개의 유전자가 n3-PUFA 이후에 상당히 변화되었음을 밝혔습니다(53개는 n3-PUFA 이후에 상향 조절되고 10개는 하향 조절됨). 이러한 유전자 중 3개는 미토콘드리아 관련 유전자로 분류되었으며, 이는 모두 n3-PUFA에 의해 하향 조절되었습니다. 보충 그림 1-6 에 포함된 히트맵은 선택된 유전자 그룹에 대해 n3-PUFA 보충 전후의 노년층에서 젊은 그룹과 관련하여 배수 변화를 보여줍니다. 산화적 인산화( 보충 그림 1 ) 및 트리카르복실산(TCA) 회로( 보충 그림 2 )와 관련된 유전자는 노년층이 젊은층에 비해 이러한 유전자의 대부분이 감소하고 n3-PUFA 이후에 더욱 감소하는 일반적인 패턴을 보입니다.
다음으로, 우리는 젊은 성인과 노년 성인에서 단일 운동에 반응하여 유의하게 상향 또는 하향 조절된 유전자를 조사했습니다. 총 2,560개의 유전자가 젊은 참가자의 운동에 반응하여 유의하게 변화했습니다(그림(그림5C).5도씨). 이러한 유전자 중 97개는 미토콘드리아 관련 유전자로 분류되었습니다(51개는 운동으로 상향 조절되고 46개는 하향 조절됨). 우리는 근육 단백질 대사 조절에 관여하는 것으로 알려진 유전자 목록을 수동으로 정리했으며, 그 중 17개는 젊은이의 운동에 의해 상당한 영향을 받는 것으로 나타났습니다(12개는 상향 조절되고 5개는 하향 조절됨). 선택된 유전자 범주에서 운동에 따른 유전자 발현 배수 변화는 보충 그림 7-13 (산화적 인산화, TCA 주기, 지질 산화, ROS 생성, 해당분해, 동화 반응 및 염증)에 나와 있습니다. 노년층의 경우 운동으로 상당히 변화하는 유전자(483개)가 훨씬 적었습니다(그림(그림5D).5일). 총 17개의 미토콘드리아 관련 유전자가 노인의 운동에 의해 변화되었으며, 14개는 상향 조절되었고 3개는 하향 조절되었습니다. 단백질 회전율에 관련된 유전자는 노인 그룹에서 운동에 대한 반응으로 변화된 유전자는 15개에 불과했습니다(9개는 상향 조절되었고 6개는 하향 조절되었습니다). 16주간 n3-PUFA 보충 후, 유사한 수의 유전자(473개)가 개입 전 측정과 비교했을 때 노인의 운동에 대한 반응으로 유의하게 변화되었습니다(그림(그림5E).5E). 미토콘드리아 유전자는 17개였으며, 14개는 운동으로 상향 조절되었고 3개는 하향 조절되었습니다. 단백질 회전율에 관여하는 유전자 2개가 n3-PUFA 보충 후 상당히 변화되었습니다(둘 다 운동으로 하향 조절됨).
그림의 벤 다이어그램그림5F5층젊은이, 노인의 n3-PUFA 투여 전, 노인의 n3-PUFA 투여 후 운동에 반응하여 유의하게 상향 또는 하향 조절된 유전자를 보여줍니다. 단일 운동은 개입 전 젊은이의 유전자 2,560개를 변화시켰지만 노인의 유전자는 483개에 불과했습니다. 젊은이와 노인 사이에는 439개의 유전자가 공통적으로 존재했습니다. 노인에게 16주간 n3-PUFA를 보충한 후, 운동에 반응하여 473개의 유전자가 유의하게 변화했습니다. 이러한 유전자 중 326개는 개입 전 유전자 반응과 공통적이었고, 398개는 젊은이의 운동에 대한 유전자 반응과 공통적이었고, 50개는 고유한 유전자였습니다. 우리는 이러한 50개의 고유한 유전자를 조사하여 단일 운동에 대한 미토콘드리아 ROS 생성의 유의한 감소, 흡수 후 근육 단백질 합성의 증가, 동화 반응의 강화를 설명할 수 있는 잠재적 메커니즘을 식별하려고 시도했습니다. 특히, 근육 성장과 증식의 부정적 조절자로 알려진 여러 유전자( dusp1, frzb, hbp1 )의 다운레귤레이션, 위축 관련 유전자( bmp6 )의 다운레귤레이션, 단백질 합성( mrps12, spon2, prox1, nos1 )과 단백질 접힘/조립( fkbp2, sptbn4 )을 촉진하는 유전자의 업레귤레이션이 있었습니다. 나아가, 염증 관련 유전자(mmd, cxcl9)의 다운레귤레이션과 TGF 베타의 작용을 상쇄하여 염증을 조절하는 지방조직 괴사성 paralig c1qtnf6 의 업레귤레이션이 있었습니다. RT-PCR로 조사한 9개 후보 유전자 중 근육 동화작용의 부정적 조절자인 미오스타틴은 n3-PUFA 보충 후 운동으로 상당한 다운레귤레이션을 보였는데, 이는 개입 전에는 나타나지 않았습니다(그림(그림 3A).3A). 요약하자면, RNA 시퀀싱은 노령 성인의 골격근에서 관찰된 미토콘드리아 표현형과 일치하는 전사적 시그니처를 밝혀냈습니다. 나아가, 단일 운동으로 유도된 전사적 변화는 젊은 사람에 비해 노령 성인에서 약화되었으며, 기저 근육 유전자 발현에 대한 n3-PUFA의 미묘한 효과 또는 단일 운동 후 유전자 발현 변화로 나타났습니다. 그러나 근육 단백질 회전율과 염증을 조절하는 소수의 유전자 발현은 노령 성인에서만 16주간 n3-PUFA를 보충한 후에만 운동으로 인해 독특하게 변화했습니다.
논의
이러한 연구에서 가장 두드러진 관찰 결과는 나이와 n3-PUFA 보충이 인간 골격근의 미토콘드리아 생리학, 단백질 대사 및 유전자 발현에 미치는 영향과 관련이 있습니다. 첫째, 이전 설치류 실험[ 43 , 44 ]과 달리 n3-PUFA는 노령 성인의 미토콘드리아 산화 능력을 증가시키지 않는 것으로 나타났습니다. 그러나 n3-PUFA 보충은 미토콘드리아 산화제 방출 속도를 감소시켰습니다. 둘째, 젊은 사람과 비교하여 운동에 대한 전사 반응이 명확히 약화되었음에도 불구하고 기준선이나 운동 후 근육 단백질 합성 속도에 연령 관련 손상이 없음을 발견했습니다. 마지막으로, 16주간 n3-PUFA 보충은 흡수 후 근육 단백질 합성(특히 미토콘드리아 및 근육질 분획)을 증가시키고 운동 후 미토콘드리아 및 근원섬유 단백질의 합성 속도를 증가시켰습니다.
흡수 후 조건에서 근육 단백질 합성에 대한 노화의 영향에 관한 선행 문헌은 엇갈리는데, 일부 연구자는 연령에 따라 FSR이 감소한다고 보고했지만[ 45 , 46 ], 다른 연구자는 그렇지 않았습니다[ 47 , 48 ]. 현재 건강한 노인 집단에서는 흡수 후 근육 단백질 합성에 차이가 없음을 관찰했습니다. 영양이나 운동 자극에 대한 동화 반응이 노화에 따라 둔화된다는 설득력 있는 증거가 있습니다[ 24-26 ] . 연령 관련 동화 저항 개념을 뒷받침하는 전사 증거를 찾았지만, 노인은 젊은 그룹과 비교했을 때 운동에 대한 반응으로 근육 단백질 합성이 현저하게 보존되었습니다. 한 가지 해석은 이러한 노인이 약화된 전사 메시지에 직면하여 어떻게든 번역 기계의 동화 반응을 일으킬 수 있다는 것입니다. 또 다른 가능성은 운동 후 단백질 합성 측정의 타이밍이 젊은이와 노인의 합성 속도가 다른 시점을 놓쳤을 수 있다는 것입니다. 우리는 이전 보고서에 근거하여 단일 운동 후 15~18시간 사이에 FSR을 측정하기로 했습니다.이전 보고서에 따르면 젊은 성인과 노년 성인의 혼합 근육 FSR은 운동 후 6시간에 최고치에 도달하고 여기에서 사용한 동일한 운동 패러다임을 사용했을 때 운동 후 최소 24시간까지 유지되었습니다[ 24 ].따라서 운동 후 15~18시간 창은 두 연령대 모두에서 최대 근육 단백질 합성을 포착해야 합니다.실제로 우리는 Fry와 동료들이 운동 후 6시간 및 24시간에 관찰한 것과 유사한 운동 후 15~18시간의 근육 단백질 합성 속도 증가를 관찰했습니다[ 24 ].
이 연구의 주요 목표는 인간 골격근에서 n3-PUFA가 미토콘드리아 생리학에 미치는 영향을 확인하는 것이었습니다. 우리는 최근 n3-PUFA의 항염 효과가 미토콘드리아 생합성의 상향 조절된 전사 조절자[ 44 ]와 노령 마우스에서 미토콘드리아 기능의 현저한 개선과 관련이 있다고 보고했습니다[ 43 ]. 마우스에서의 이러한 초기 관찰은 이러한 미토콘드리아 적응이 노령 인간에서도 명백한지 확인하기 위한 현재 연구에 활력을 불어넣었습니다. 마우스에서의 이전 관찰과는 대조적으로, 16주간 고용량 n3-PUFA는 노령 인간의 미토콘드리아 용량을 개선하지 못했습니다(그림(그림2),2), 또한 산화적 인산화( 보충 그림 1 ), TCA 주기( 보충 그림 2 ), 지질 대사( 보충 그림 3 )에 관여하는 단백질을 인코딩하는 유전자의 mRNA 수치가 증가하지 않았습니다. 이 발견은 n3-PUFA 보충이 근육 미토콘드리아 에너지를 변화시키지 않는 과체중 인슐린 저항성 개인에 대한 이전 연구와 일치합니다[ 49 ]. 마찬가지로 Herbst 등이 실시한 최근 연구에서는 12주간 n3-PUFA 보충이 최대 상태 3 호흡을 증가시키지 않고도 ADP에 대한 미토콘드리아 민감도를 증가시켰다는 것을 발견했습니다[ 50 ]. 우리는 미토콘드리아의 생체 에너지 효율성의 변화를 나타낼 호흡 조절 비율(상태 3/상태 4) 또는 ADP:O 비율의 변화를 관찰하지 못했습니다.
미토콘드리아 산화제 방출은 미토콘드리아 건강을 정의하는 데 도움이 되는 또 다른 매개변수입니다. 이 연구에서는 미토콘드리아 ROS 생성의 연령 관련 증가가 나타나지 않았지만, 우리는 n3-PUFA 투여 후 노인에서 ROS 방출이 상당히 낮다는 것을 발견했습니다. 다중불포화 지방산은 항산화 특성을 가지고 있다고 제안되었지만[ 51 ], 이러한 생물학적 활성 지질이 미토콘드리아의 산화제 방출 잠재력에 직접적인 영향을 미친다는 것을 보여주는 선례 문헌은 알지 못합니다. 우리는 n3-PUFA가 미토콘드리아 ROS 생성을 감소시키는 메커니즘을 모르지만, n3-PUFA가 노인에서 ROS 생성을 감소시킨다는 발견은 노화에 따른 근육 건강의 관점에서 중요합니다. 노화는 종종 산화 스트레스 증가와 골격근의 손상된 단백질 축적을 동반합니다[ 52-54 ] . 근육 프로테옴의 품질과 기능을 보존하는 안전하고 효과적인 방법을 발견하면 골격근의 많은 연령 관련 장애를 예방하는 데 도움이 될 것입니다. 이를 뒷받침하기 위해 우리는 이전에 n3-PUFA가 노령 쥐의 근육에서 단백질의 번역 후 변형을 감소시킨다는 사실을 발견했습니다[ 43 ]. 이 발견은 ROS 생성과 내인성 항산화제에 의한 ROS 소거에 대한 n3-PUFA의 효과와 관련이 있을 가능성이 높습니다.
n3-PUFA의 잠재적인 동화작용 효과는 노인 여성의 훈련에 대한 근력 증가를 n3-PUFA 보충이 증가시킨다는 관찰 결과에서 시사됩니다[ 37 ]. Smith와 그의 동료들이 수행한 일련의 논문에서 8주간 n3-PUFA 보충을 하면 젊은 성인, 중년 성인, 노년 성인의 고아미노산혈증-고인슐린혈증 클램프 동안 단백질 합성 속도가 증가한다는 사실이 추가로 입증되었습니다[ 35 , 55 ]. 이러한 초기 연구에 동기를 부여받아, 우리는 n3-PUFA가 노년 성인의 단일 운동에 대한 동화작용 반응을 강화할 수 있는지 확인했습니다. Smith et al.[ 35 ] 과 일치하게, 우리는 n3-PUFA를 투여한 노년 성인의 기저 후 흡수 상태에서 혼합 근육 단백질 합성 속도에 유의미한 변화를 발견하지 못했습니다. 그러나 세포 내 풀에서 단백질 합성 속도를 조사했을 때, 우리는 n3-PUFA가 미토콘드리아와 근육질 풀에서 FSR을 유의미하게 증가시킨다는 것을 발견했습니다. 오메가-3 지방산은 또한 단일 운동 후 근육 단백질 합성을 강화하는데, 주로 미토콘드리아와 근원섬유 분획에서 그러하다.이러한 결과는 n3-PUFA가 인슐린과 아미노산에 대한 동화 반응을 향상시킨다는 이전의 증거와 결합하여, n3-PUFA가 노인의 영양과 신체 활동에 대한 근육 동화 반응을 증가시킨다는 것을 시사한다.최근 논문[ 56 ]은 8주 동안 5g/일의 생선 기름을 투여받은 젊고 건강한 남성을 대상으로 매우 유사한 실험 설계를 사용했다.근육 단백질 합성은 휴식 시, 식이 단백질 볼러스 후, 단백질 볼러스로 추적한 단일 운동 후에 측정했다.이러한 젊은 남성의 근육 단백질 합성에 대한 n3-PUFA의 영향은 없었는데, 이는 노인 남성과 여성에서 우리가 발견한 결과와 대조적이다.mcGlory 등의 연구와 연구의 주요 차이점은 다음과 같다. 그리고 현재 연구는 운동 후 생체검사 시기, 운동 전 식이 단백질 추가, 피험자 특성으로, 이 모든 것이 두 연구 간의 데이터나 결론을 외삽하기 어렵게 만듭니다. 일부 개인은 운동으로 자극된 단백질 합성에서 강력한 증가를 보인 반면 다른 개인은 그렇지 않은 반응자와 비반응자 클러스터를 관찰했다는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 반응자와 비반응자를 측정된 특성, 생화학적 마커 또는 표현형과 연결하려는 시도는 명확한 구별 요소를 발견하지 못했지만, 현재 연구는 이러한 유형의 탐색적 분석에 대한 표본 크기가 작다는 제한이 있습니다. 특히, 그림에서 관찰된 높은 반응자는그림44대부분 여성이었습니다. 이 관찰은 n3-PUFA가 노년 여성의 골격근 기능과 질을 개선했지만 노년 남성에게는 개선하지 않았다는 최근 연구와 일치합니다[ 38 ]. 위약 대조군을 포함한 더 큰 집단에서 추가 연구가 필요하여 n3-PUFA의 동화작용이 남성과 여성 간에 다를 가능성을 더욱 조사해야 합니다.
n3-PUFA가 흡수 후 및 운동으로 자극된 단백질 합성을 증가시키는 메커니즘을 파악하기 위해 우리는 먼저 RT-PCR을 사용하여 운동에 대한 반응으로 근육 단백질 회전을 조절하는 것으로 알려진 여러 유전자의 발현을 평가했습니다(그림(그림 3).3). 사전에 확인된 9개의 유전자 중에서 운동에 대한 반응으로 발현이 n3-PUFA에 의해 변화되는 유전자로 미오스타틴만 나타났다. 근육 성장과 분화의 부정적 조절자로서, n3-PUFA에 따른 운동 후 미오스타틴 수치가 상당히 낮아진 것은 운동에 대한 향상된 동화 반응을 부분적으로 설명할 수 있다. 그런 다음 우리는 근육 단백질 대사를 조절하는 것으로 알려진 유전자에 대한 RNA 시퀀싱 데이터 세트를 마이닝했다( 보충 그림 12 ). 전반적으로 유전자 세트에는 명확한 변화가 없지만, 여러 개별 유전자는 n3-PUFA에 따라 더 큰 변화를 보였다. 이러한 유전자에는 미오스타틴( mstn ), 여러 E3 리가제의 발현을 제어하여 근육 소모를 매개하는 포크헤드 전사 인자 foxo1 , 근섬유 비대에서 중요한 신호 전달 중간체인 칼시뉴린 A( ppp3ca )가 포함되었다. 다음으로, 우리는 n3-PUFA 보충 후 운동으로 고유하게 변화하지만 개입 전에는 변화하지 않는 유전자를 확인했다(그림(그림5F).5층). 근육 성장 및 증식의 여러 음성 조절자( dusp1, frzb, hbp1 )가 하향 조절되었고, 위축 관련 유전자( bmp6 ) 하나가 하향 조절되었으며, 단백질 합성을 촉진하는 여러 유전자( mrps12, spon2, prox1, nos1 )와 단백질 접힘/조립( fkbp2, sptbn4 )이 상향 조절되었습니다. 이러한 결과는 n3-PUFA가 노인의 골격근에서 세포외 기질 조직과 관련된 유전자의 발현을 증가시키고 단백질 분해와 관련된 유전자를 감소시킨다는 것을 보여주는 Yoshino et al. [ 57 ]의 최근 결과와 일치합니다. 전체적으로 이러한 데이터는 n3-PUFA가 근육 단백질 회전율을 증가시키는 골격근의 전사 패턴을 변경한다는 것을 시사합니다. 다른 연구에서는 n3-PUFA가 mTOR 및 p70s6k와 같은 근육의 신호 전달 단백질의 인산화를 변경하여 운동에 대한 동화 반응을 향상시킬 수 있음을 보여줍니다 [ 35 ]. 종합해 보면, n3-PUFA의 동화작용은 전사 변화뿐만 아니라 골격근의 동화작용 신호 전달 단백질 활성화의 변화에 의해 매개되는 것으로 보인다.
만성 염증이 영양과 운동에 대한 근육의 동화 반응에 영향을 미칠 수 있다는 증거가 늘어나고 있습니다. mRNA의 번역 효율성은 높은 수준의 염증성 사이토카인[ 31 ]에 의해 손상되고 노인의 근육 단백질 합성은 염증성 사이토카인 수준과 반비례합니다[ 32 , 33 ]. 염증이 근육 단백질 동화 작용을 억제하여 근육 감소증에 기여할 수 있다는 가설은 비스테로이드성 항염제를 사용하여 염증을 줄이면 식후 단백질 합성이 개선되고[ 34 ] 노인의 저항 운동에 대한 반응으로 근육량과 근력이 향상된다는 연구 결과에서 더욱 뒷받침됩니다[ 36 , 37 ]. n3-PUFA의 잘 문서화된 항염 효과[ 41 , 42 ]를 감안할 때 이 연구에서 관찰된 근육 단백질 합성의 증가는 만성 염증이 감소한 결과일 수 있다고 기대하는 것이 합리적입니다. 그러나 우리는 16주간 고용량 n3-PUFA 보충이 전신 염증 표지자 TNF-ɑ, CRP 또는 IL-6를 감소시키지 않는다는 것을 발견했습니다(표(표2).2). 이 발견은 다른 연구 결과[ 35 , 38 ] 와 일치 하며, 염증 상태가 높은 환자는 n-3 PUFA로 인해 염증 표지자, 대사 프로필 및 근육 소모가 개선될 가능성이 더 높기 때문에 우리 집단의 건강 상태를 반영하는 것일 수 있습니다[ 58-60 ]. 그럼에도 불구하고 근육 수준에서는 염증 관련 유전자( mmd , cxcl9 )의 다운레귤레이션과 노인의 TGF 베타 작용을 상쇄하여 염증을 조절하는 지방조직 패럴로그 c1qtnf6 의 업레귤레이션이 있었습니다(그림(그림5F).5층). n3-PUFA가 순환 염증 표지자에 영향을 주지 않고 국소 조직 염증을 조절할 가능성은 추가 연구가 필요합니다.
연구의 주요 한계는 위약 대조군이 없는 개방형 설계입니다. 나아가 표본 크기가 작아서 성별 차이에 대한 적절한 사후 탐색이나 반응자와 비반응자를 예측할 수 있는 요인을 확인하는 것이 불가능합니다. 이 연구의 참여자는 광범위한 포함 및 제외 기준을 충족한 후에만 포함되었으며, 특히 노령 인구 전체로 일반화할 때 결과의 외부 타당성이 제한됩니다. 이 연구의 장점 중 하나는 높은 준수율, 최소 탈락율, 적절한 기간 동안 n-3 PUFA의 약리적 복용량이었습니다. 주요 결과를 평가하는 데 금본위 방법을 사용했으며, 연구는 임상 연구 및 시험 부서의 엄격하게 통제된 환경에서 수행되었으며, 참여자는 병원에서 표준화된 식사를 3일간 제공받은 후 2박을 입원했습니다.
결론적으로, 우리는 식이 n3-PUFA가 노인의 골격근 내에서 미토콘드리아 ROS 생성 감소, 근육 단백질 합성 속도 증가, 단일 운동에 대한 향상된 동화 반응 등 잠재적으로 유리한 적응을 유도한다는 것을 보여줍니다. 이러한 적응이 n3-PUFA를 장기간 투여하거나 운동 훈련 프로그램과 함께 투여할 때 노인의 대사 및 신체 기능에 의미 있는 개선으로 이어지는지 확인하기 위한 향후 연구가 필요합니다.
재료 및 방법
연구 참여자
지역 사회에서 12명의 젊은(18-35세) 남녀와 12명의 노년층(65-85세) 남녀를 모집하여 Mayo Foundation Institutional Review Board의 승인을 받은 서면 동의를 제공했습니다. 이 연구는 헬싱키 선언에 명시된 원칙을 준수했습니다. 연구 시작 3개월 이내에 n-3 PUFA 보충제를 섭취하거나 체계적인 운동(30분 이상, 주 3회 이상)에 참여한 참가자는 제외했습니다. 또한 생선이나 조개류 알레르기, 빈혈(여성의 경우 헤모글로빈 <11 g/dL, 남성의 경우 <12 g/dL), 당뇨병(또는 공복 혈당 ≥126 mg/dL), 심혈관 질환, 간, 신장 또는 치료되지 않은 갑상선 질환, 연구의 운동 부분 참여를 방해할 수 있는 근골격계 또는 폐 질환이 있는 참가자도 제외했습니다. 임신, 모유 수유, 흡연 및 기타 약물 남용도 제외되었으며, 근육 대사에 영향을 미치는 약물(베타 차단제, 코르티코스테로이드, 삼환계 항우울제, 벤조디아제핀, 아편제, 바르비투르산염) 및 항응고제도 제외되었습니다. 스타틴 또는 경구 에스트로겐은 제외하지 않았습니다. 모든 참가자는 스크리닝 방문을 완료한 후 근육 단백질 합성, 급성 운동 반응성 및 미토콘드리아 생리학을 평가하기 위해 2일간 입원 연구를 수행했습니다. 노령 참가자는 식이 n3-PUFA(3.9g/일)의 4개월 개방형 개입 후 다시 연구되었습니다. 젊은 참가자는 노화에 따른 골격근 기능 장애의 정도를 확인하기 위해 비교 그룹으로 연구되었으며 어떠한 개입도 받지 않았습니다. 연구 설계는 그림에 설명되어 있습니다.그림11.
상영
적격 참여자는 전화 또는 이메일을 통한 스크리닝 설문지를 통해 확인되었습니다. 적격 기준을 충족하는 사람은 전날 밤 22:00시부터 금식한 후 Mayo Clinic Hospital, St. Marys Campus의 임상 연구 및 시험 부서(CRTU)에 보고하여 신체 검사, 휴식 심전도 및 완전 혈구 수와 포도당, 인슐린, Hba1c, 간(ALT, AST, 빌리루빈), 신장(크레아티닌, GFR) 및 갑상선(TSH) 기능, 응고(INR) 및 지질 패널(총, LDL, HDL-콜레스테롤, 트리글리세리드)의 생화학 검사를 포함한 종합 혈액 검사를 통해 적격성을 평가했습니다. 참가자들은 영양사와 상담하여 음식 선호도를 논의하고, 이중 에너지 X선 흡수 측정법(DEXA)으로 신체 구성을 측정하여 전신 지방량, 체지방, 제지방 체중(FFM)을 파악했습니다(Lunar DPX-; Lunar Radiation, Maddison, WI).
VO2 피크
전신 최대 산소 섭취량(VO 2 피크)은 이전에 설명한 바와 같이 증가 작업 부하를 사용하여 고정 사이클 에르고미터에서 간접 열량 측정법으로 측정했습니다[ 49 ].VO 2 피크 프로토콜은 젊은 성인과 노년 남성의 경우 50와트, 노년 여성의 경우 25와트의 작업 부하에서 시작하여 젊은 남성의 경우 2분마다 30와트, 젊은 여성과 노년의 경우 20와트씩 증가시켰습니다. 참가자는 휴식, 운동 및 회복 기간 내내 12 리드 ECG, 혈압 및 호기 가스를 통해 모니터링되었습니다. 주관적인 피로 수준은 Borg 척도를 사용하여 평가했습니다.
1회 반복 최대치(1RM)
연구원의 지도 하에 왼쪽 다리의 최대 무릎 신근력을 두 번 별도로 평가했습니다. 프로토콜에는 가벼운 무게를 사용하여 10회 반복하는 워밍업 세트와 그 다음에 3분 간격으로 최대 10회 반복하는 2세트가 포함되었습니다. 1RM은 다음 공식을 사용하여 두 세트의 평균에서 계산했습니다. 1RM = ω·(1+r/30), 여기서 ω는 임의의 단위의 무게이고 r은 세트당 반복 횟수입니다.
입원 환자 연구 설계
참가자는 VO 2 피크 테스트 후 최소 7일 후에 CRTU에 입원했습니다. 입원하기 전 3일 동안 CRTU 대사 주방에서 체중 유지 식단을 제공했습니다. 식단의 거대 영양소 분포는 단백질 20%, 탄수화물 50%, 지방 30%였습니다. 식단 3일째 저녁 , 참가자는 17:00시에 CRTU에 입원했고 22:00시 이후에는 물만 섭취했습니다. 05:00시에 그림과 같이 13 C 6 -페닐알라닌의 프라이밍된(1.5 mg·kg FFM -1 ), 연속 주입(1.5 mg·kg FFM -1 ·hr -1 ) 을 시작했습니다.그림 1B.1B. 휴식 에너지 소모량(REE)은 환기 후드와 간접 열량 측정법을 사용하여 0630시에 시작하여 20분 동안 측정했습니다[ 49 ]. 근육 생체 검사는 정맥으로 표지된 아미노산을 근육 단백질 풀에 통합하여 흡수 후 단백질 합성 속도를 측정하기 위해 0800시와 1100시에 오른쪽 vastus lateralis 에서 얻었습니다. 생체 검사는 변형된 Bergstrom 바늘을 사용하여 국소 마취(2% 리도카인) 하에 수집했습니다. 1200시에 생체 검사 후 참가자에게 20% 단백질, 50% 탄수화물, 30% 지방으로 구성된 10kcal/kg의 표준화된 식사가 제공되었습니다. 1600시에 참가자는 왼쪽 다리만을 사용하여 앉은 상태에서 편측 다리 폄을 수행했습니다. 워밍업 세트에 이어 피험자들은 외래 방문 시 결정한 1 RM의 70%에서 10회 반복을 8세트 완료했습니다. 세트 사이에 3분의 휴식을 취했습니다. 이 운동 패러다임은 이전에 노화에 따른 근육 동화 반응에 대한 급성 저항 운동의 효과를 평가하는 데 사용되었습니다[ 24 ]. 이 운동은 Saint Mary's Hospital의 Dan Abraham Healthy Living Center에서 연구팀 구성원이 감독했으며, 참가자들은 휠체어를 사용하여 안내되었습니다. 체중 유지를 위해 열량이 포함된 두 번째 식사는 18:00에 제공되었고, 그 후 참가자들은 2일차에 두 번째 단백질 합성 측정 세트가 있을 때까지 금식을 유지했습니다. 추적자 주입은 04:00에 시작되었고, 그 후 07:00과 10:00에 운동한 다리에 대한 두 번의 연속 근육 생검이 이어졌습니다. 참가자들에게 식사가 제공되었고 두 번째 날 정오에 퇴원했습니다.
n-3 PUFA 개입
n3-PUFA 소프트젤은 Sancilio and Company, Inc.(플로리다주 리비에라 비치)에서 공급하였으며, Mayo Clinic Research Pharmacy에 실온에서 보관하였습니다.연구의 개입 기간 동안, 참가자들은 식사와 함께 하루에 두 번 소프트젤 2개를 삼키도록 지시받았습니다.n3-PUFA 소프트젤에는 EPA 675mg과 DHA 300mg이 포함되어 총 일일 복용량은 3.9g/일이고 EPA:DHA 비율은 2.25입니다.각 캡슐의 총 오메가-3 지방산 함량은 1050mg이었고, 여기에는 "비 n3-PUFA" 오메가-3 지방산 75mg도 포함되었습니다.캡슐의 총 지방 함량은 1200mg이었습니다.이 n3-PUFA 복용량은 고인슐린혈증과 고아미노산 상태에서 골격근의 동화 반응을 증가시키는 것으로 나타났기 때문에 선택되었습니다[ 55 ]. 4주마다 참가자들은 CRTU로 돌아와 새로운 처방전을 받고, 남은 캡슐을 반환하고, 공복 혈액 샘플을 제공했습니다. Mayo Clinic Research Pharmacy는 준수를 위해 수령, 분배 및 반환 알약 수에 대한 기록을 유지했습니다. 준수는 또한 연구 종료 시 적혈구(RBC)의 EPA 및 DHA 함량을 매월 측정하고, 질량 분석법으로 측정한 EPA 및 DHA의 혈장 수치를 통해 평가했습니다. 개입 기간은 4개월이었습니다.
근육 미토콘드리아 기능
미토콘드리아 산화 능력
1일차 첫 번째 근육 생검 직후 약 60mg의 신선한 근육 조직을 얼음 위에서 균질화했습니다.미토콘드리아는 차등 원심분리로 분리하여 이전에 설명한 대로 호흡 완충액(MiR05; Oroboros, Innsbruck, Austria)에 현탁했습니다[ 61 ].분리된 미토콘드리아의 호흡은 전자 전달 시스템의 다양한 구성 요소를 평가하기 위한 단계적 프로토콜을 사용하여 고해상도 호흡 측정법(Oxygraph 2K, Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria)으로 측정했습니다[ 49 , 53 ].산소 유량 속도( JO 2 )는 탄수화물(글루타메이트 + 사과산)과 지질(팔미토일-L-카르니틴) 기질이 있는 상태에서 평가했습니다[ 61 ].미토콘드리아 단백질 함량은 비색 분석법(Pierce 660-nm Protein Assay)을 사용하여 측정했습니다. 산소 소비량은 조직 습윤 중량으로 표현되었고 미토콘드리아 단백질 함량으로 정규화되었습니다. 미토콘드리아 결합 효율은 상태 3과 상태 4 호흡의 몫으로 계산된 호흡 조절 비율(RCR)에서 측정되었습니다. ADP:O 비율은 챔버에 추가된 ADP의 양을 상태 III 호흡 중에 사용된 원자 산소의 양으로 나누고 PRISM v6.0e 소프트웨어(GraphPad Software Inc, La Jolla, CA)를 사용하여 결정했습니다.
미토콘드리아 반응성 산소종(ROS) 생성
분리된 미토콘드리아에서 과산화수소 생산( mt H 2 O 2 )은 이전에 설명한 바와 같이 산소 소비 측정에 대해 설명한 것과 동일한 호흡 조건에서 Amplex Red의 산화를 지속적으로 모니터링하여 Fluorolog 3 분광형광계(HORIBA Jobin Yvon)로 측정했습니다[ 44 , 53 ]. 형광 신호는 배경 자동 산화에 맞게 조정하고 표준 곡선으로 교정했습니다. H 2 O 2 생산 속도는 조직 습윤 중량과 미토콘드리아 분리체의 단백질 함량에 따라 정규화했습니다.
근육 단백질 합성 속도
근육 조직액과 근육 단백질 풀의 동위원소 농축은 이전에 설명한 바와 같이 HPLC와 탠덤 질량 분석법(MS/MS)으로 측정했습니다[ 44 , 53 , 62 , 63 ]. 간단히 말해, 총 혼합 근육, 근원섬유, 미토콘드리아 및 근육질(세포질)과 조직액의 유리 아미노산 분획이 10mg의 대퇴사두근에서 분리되었습니다. 단백질은 110°C에서 6N HCL에서 하룻밤 동안 가수분해되었습니다. 조직액과 가수분해된 단백질의 페닐알라닌은 양이온 교환 컬럼-AG50을 통해 추가로 분리되었고 이소부틸 에스테르로 유도체화되기 전에 건조되었습니다. 데이터 수집은 양성 전기 분무 이온화 모드에서 수행되었으며, 페닐알라닌의 m+2 및 m+6 단편과 L-[고리 13 C 6 ]-페닐알라닌에 대해 각각 222.4 > 121.6 및 226.4 > 125.6에서 이온 모니터링을 선택했습니다. 몰 백분율 농축(MPE)은 6점 농축 표준 곡선에 대해 계산했습니다. 혼합 근육, 근원섬유, 미토콘드리아 및 근육질 단백질의 분획 합성률은 다음 공식에 따라 조직액 13 C 6 - 페닐알라닌 의 평균 농축을 전구체 풀 농축(Ep)으로 사용하여 두 개의 연속 근육 생검(E 2 -E 1 )에서 13 C 6 - 페닐알라닌 농축의 증가에서 계산했습니다. FSR = (E 2 -E 1 ) ·100/ Ep · 시간 [%·h −1 ].
정량적 PCR
약 20mg의 근육을 액체 질소에 가루로 만들고 DNAse 처리 키트(RNeasy Fibrous Tissue, Qiagen)를 사용하여 총 RNA를 추출했습니다. RNA 농도와 순도(모든 샘플에 대해 A260/A280>2.0)는 분광 광도법(Nanodrop)으로 결정했습니다. 2마이크로그램의 RNA를 제조업체의 지침(Applied Biosystems)에 따라 cDNA로 역전사했습니다. 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR)은 20ng의 cDNA를 사용하여 20μl 반응 부피의 384웰 투명 플레이트에서 수행했습니다. 증폭 조건은 60°C에서 10분, 그 다음 ViiA7 열 순환기(Applied Biosystems)를 사용하여 변성(95°C에서 15초)과 어닐링(60°C에서 60초)을 40회 반복했습니다. 샘플은 '템플릿 없음' 대조군, 내부 반복 대조군 및 4 log 희석에 걸친 7점 상대 표준 곡선이 있는 단일 플레이트에서 3회씩 다중 조건으로 증폭되었습니다. 프라이머와 프로브는 보충 표 1 에 표시된 대로 9개 유전자 표적에 대해 상업적으로 생산되었습니다(Applied Biosystems, TaqMan Gene Expression Assays). 표적 및 참조 유전자의 효율성은 표준 곡선에서 유사했습니다(약 95-100%). 상대적 폴드 변화는 정지 생검 샘플을 대조군 조건으로 하는 2-ΔΔCt 접근법[ 64 ] 을 사용하여 결정했습니다 .
mRNA 시퀀싱
영어: 위에서 설명한 대로 총 RNA를 분리하고 RNA 라이브러리는 TruSeq RNA Sample Prep Kit v2(Illumina)에 대한 제조업체의 지침에 따라 준비했습니다. 라이브러리는 Illumina cBot 및 cBot Paired end cluster kit 버전 3의 표준 프로토콜에 따라 paired end flow cells에 로드했습니다. Flow cells은 TruSeq SBS 시퀀싱 키트 버전 3 및 HCS v2.0.12 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 Illumina HiSeq 2000에서 51 × 2 paired end reads로 시퀀싱했습니다. Illumina의 RTA 버전 1.17.21.3을 사용하여 베이스 콜링을 수행했습니다. RNA-Seq 데이터는 Mayo Bioinformatics Core 파이프라인인 MAP-RSeq v.1.2.1[ 65 ]을 사용하여 분석했습니다. MAP-RSeq는 hg19 게놈 빌드에 대한 TopHat 2.0.6 [ 66 ] 정렬과 Illumina에서 얻은 유전자 주석 파일( http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html )을 사용한 HTSeq 소프트웨어 0.5.3p9(http://www.huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/overview.html)를 사용한 유전자 계수 로 구성됩니다. 정규화 및 차등 발현 분석은 edgeR 2.6.2 [ 67 ] 를 사용하여 수행되었습니다 .
분석 방법
포도당은 광도 헥소키나아제 방법을 통해 혈장 샘플에서 측정했습니다. 인슐린은 전기화학발광면역측정법 "ECLIA" 검출(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)을 사용하는 2부위 면역측정법으로 측정했습니다. HOMA-IR 지수는 다음 공식으로 계산했습니다. 공복 포도당(mmol/L) x 공복 인슐린(μIU/mL)/22.5 [ 68 ]. 인터루킨(IL)-6, IL-1β 및 종양괴사인자 알파(TNF-α)는 Quantikine 고감도 면역측정법을 통해 고상 ELISA를 통해 혈청 샘플에서 측정했습니다. 렙틴과 아디포넥틴은 방사면역측정법을 통해 측정했고, C-반응성 단백질은 입자 증강 면역 탁도 측정법을 통해 측정했습니다. 혈액 측정은 Mayo Clinic 면역화학 핵심 연구실에서 수행했습니다. 플라스마 유리지방산은 이전에 설명한 바와 같이 Agilent 6460 삼중 사중극 액체 크로마토그래피/질량 분석기(LC/MS)의 표준 곡선에 대해 측정되었습니다[ 69 ].
통계적 방법론
쌍을 이루지 않은 t 검정은 개입 전 젊은 그룹과 노년 그룹 간의 미토콘드리아 매개변수(호흡률, ROS 생성)를 비교하는 데 사용되었습니다. 쌍을 이룬 t 검정은 노년층에서 n3-PUFA 보충이 이러한 변수에 미치는 영향을 조사하는 데 사용되었습니다. 운동 전후의 유전자 발현 및 FSR과 같이 여러 시점에서 측정된 변수의 경우, 쌍을 이룬 t 검정(젊은 그룹의 운동 전 대 운동 후, 노년층의 운동 전 대 운동 후, 개입 전 대 개입 후 운동 전)을 사용하여 사전 비교를 수행했으며, t 검정에 의한 쌍을 이루지 않은 비교(기준선 젊은 그룹 대 기준선 노년층, 운동 후 젊은 그룹 대 운동 후 노년층)도 수행했습니다. 변수가 정규 분포되지 않은 경우 노년층의 개입 전-후에 Wilcoxon 부호 순위 검정을 사용했으며, 두 연령대의 운동 전-후 비교에도 사용했습니다. 연속 변수는 적절한 경우 평균 ± SD 또는 중앙값(사분위 범위, IQR)을 사용하여 요약했습니다. 통계 분석은 JMP 소프트웨어(SAS Institute, Cart, NC)와 PRISM v6.0e(GraphPad Software Inc, La Jolla, CA)를 사용하여 수행했습니다. 그림의 벤 다이어그램그림55EulerAPE v3( eulerdiagrams.org ) 를 사용하여 생성되었습니다 .
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