푸라논-30(Fu-30)

P. aeruginosa 에 대한 강력한 항독성 및 쿼럼 감지 억제제인 ​​합성 브롬화 푸라논(Fu 30) ( Manefield et al., 2002 ; Henzter et al., 2003 )은 상업적으로 구입 가능합니다.

피오시아닌-아스코르브산 상호작용

피오시아닌(100 μM)을 아스코르브산(산성(pH 6-4)과 pH 7 모두)과 1:1(100 μM:100 μM), 1:20(100 μM:2000 μM) 및 1:100(100 μM:10000 μM)의 비율로 혼합하고 실온(25 ± 1°C)에서 배양했습니다. 피오시아닌 색상은 다른 시간 지점(0, 24, 48, 72, 96, 120, 144 및 168시간)에서 사진을 찍었습니다. 대조군으로 피오시아닌을 구연산(산성(~4)과 pH 7 모두)과 1:20의 비율로 혼합했습니다. 피오시아닌은 또한 1:10, 1:20 및 1:100의 비율로 데히드로아스코르브산(pH 7)과 혼합되었습니다.

아스코르브산, 구연산(산성과 pH 7 모두) 또는 데히드로아스코르브산이 존재할 때 피오시아닌 흡광도 피크의 변화를 조사하기 위해, 피오시아닌-아스코르브산 혼합물(비율 1:0, 1:1, 1:5; 1:10 및 1:20), 피오시아닌-구연산 혼합물(1:20) 및 피오시아닌-데히드로아스코르브산 혼합물(1:10, 1:20 및 1:100) 200 μL를 96웰 플레이트의 웰에 실온(25 ± 1°C)에서 배양했습니다. 혼합물의 흡광도는 플레이트 리더(Tecan infinite M1000 Pro, ThermoFisher, Scoresby, Australia)를 사용하여 다른 시간 지점(0, 24, 48, 72, 96, 120시간)에서 300~800 nm에서 기록했습니다. 피오시아닌 농도는 모든 연구에서 일관적이었습니다(100 μM). 아스코르브산, 데히드로아스코르브산 및 시트르산만의 흡광도도 동일한 시점에서 기록되었습니다.

피오시아닌-아스코르브산 상호작용의 NMR 분광 분석

피오시아닌-아스코르브산 복합체의 양성자 NMR 스펙트럼을 결정하기 위해, 피오시아닌-아스코르브산 혼합물을 멸균된 탈이온수에 1:10(피오시아닌 100 μM: 아스코르브산 1,000 μM)의 비율로 제조하고 실온(25 ± 1°C)에서 2시간과 72시간 동안 배양했습니다. 배양 후, 샘플을 NMR 튜브(ThermoFisher)에 넣고, Bruker Avance 600 MHz 분광기를 사용하고 용매(물) 억제 기술을 적용하여 ¹ H NMR 스펙트럼을 기록했습니다( 보충 자료 참조 ). 피크(백만 분율; ppm)의 화학적 이동(d)을 기록했습니다.

피오시아닌-아스코르브산 상호작용의 밀도함수 이론 분석

양자 역학의 기본 법칙을 기반으로 하는 DFT 계산 방법은 피오시아닌과 아스코르브산 사이의 분자적 상호 작용을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 연구는 스웨덴 국가 컴퓨팅 인프라(SNIC)에서 수행되었습니다.

피오시아닌-아스코르브산의 클로로포름 추출

피오시아닌-아스코르브산 혼합물은 1:20(피오시아닌 50 μM: 아스코르브산 1,000 μM) 및 1:100(피오시아닌 50 μM: 아스코르브산 10,000 μM)의 비율로 제조했습니다. 이 혼합물을 실온(25 ± 1°C)에서 2시간과 72시간 동안 배양한 다음 클로로포름-HCl 분석법( Essar et al., 1990 ; Kapadia et al., 2022 )을 사용하여 피오시아닌을 추출했습니다. 간략히 말하면, 피오시아닌-아스코르브산 혼합물을 클로로포름(Univar., Ingleburn, Australia)과 혼합하여 15 mL 팔콘 튜브에 혼합물 1,000 μL당 클로로포름 300 μL의 희석 인자를 넣고 손으로 격렬하게 흔들고 즉시 5초 동안 진탕한 후 4°C에서 10분 동안 4500 × g로 원심분리했습니다. 클로로포름은 혼합물에 잔류하는 피오시아닌을 파란색 층으로 분리합니다. 파란색 층을 조심스럽게 새 튜브에 피펫으로 옮긴 다음 0.2 M 염산(HCl)으로 파란색 용액 1,000 μL당 0.2 M HCl 500 μL의 비율로 처리했습니다. HCl-blue 피오시아닌 혼합물을 다시 수동으로 흔든 다음, 즉시 5초 동안 진탕하고 10분 더 원심분리했습니다(4,500 × g; 4°C). 최종 산성화된 피오시아닌은 위쪽 분홍색 층으로 나타났고, 그 분홍색 층 200 μL를 96웰 플레이트의 웰에 첨가하고, 플레이트 리더를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 기록했습니다. 순수 피오시아닌에 의해 주어진 흡광도를 100%로 취하여 사용했고, 피오시아닌-아스코르브산 혼합물의 흡광도를 순수 피오시아닌에 대해 평가했습니다.

원형이색성을 이용한 피오시아닌과 페나진의 DNA 상호작용 연구

Chirascan Circular Dichroism 분광기(Applied Photophysics, Applied Photophysics Limited, Surrey, United Kingdom)를 사용하여 피오시아닌 또는 페나진과 DNA 간의 상호 작용을 조사했습니다. 송아지 흉선 이중 가닥(ds) DNA(Sigma Aldrich, Australia)의 혼합물(150ng/μL)과 다양한 피오시아닌 또는 페나진(0, 25, 50 및 100μM) 농도의 Milli-Q 물을 실온(25±1°C)에서 15분간 배양했습니다. 배양 후 혼합물의 흡광도를 1mm 경로 길이의 석영 큐벳에서 200~320nm(0.5s/nm의 스캔 속도)에서 스캔했습니다. 피오시아닌/페나진 결합으로 인한 DNA 흡광도 피크의 이동을 기록하여 CD-mdeg 대 파장-nm로 표시했습니다.

아스코르브산이 DNA에 미치는 영향

형광 측정법을 사용하여 아스코르브산이 ds DNA에 미치는 영향을 조사했습니다. dsDNA(200 ng/μL)를 실온(25 ± 1°C)에서 2시간과 72시간 동안 배양했으며, 고유 pH와 중성 pH에서 아스코르브산(50 및 1,000 μM)이 있거나 없는 상태에서 배양했습니다. 2시간과 72시간 후, 형광 염색법(dsDNA BR; Qubit, Invitrogen)을 사용하여 dsDNA 농도를 정량화하고 Qubit 3.0 형광계(Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, United States)로 모니터링했습니다. 대조군으로, 피오시아닌(50 μM), 피오시아닌-아스코르브산 혼합물(비율 1:1 및 1:20), DNase I-50 단위(DNase I 재조합, RNase 없음, Roche 및 Merck에서 제공)도 ds DNA와 함께 배양하고, dsDNA 농도의 고갈을 2시간 및 72시간에서 기록했습니다.

아스코르브산이 DNA-피오시아닌 상호작용에 미치는 영향을 분석하기 위한 에티듐브로마이드 치환법

아스코르브산이 피오시아닌이 ds DNA에 결합하는 것을 방해하는 능력은 에티듐 브로마이드(EtBr)-DNA 치환 기술( Das et al., 2015 )을 사용하여 평가했습니다. 이중 가닥 DNA를 SHE 완충액(2 mM HEPES, 10 mM EDTA 및 9.4 mM NaCl in Milli-Q water, NaOH로 pH 7로 조정)에서 에티듐 브로마이드(4 mM)와 혼합하고, 615 nm에서의 형광 방출(480 nm에서 여기)을 1 mL 석영 큐벳에서 Varian Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer, Agilent, United States를 사용하여 실온(25 ± 1°C)에서 정량화했습니다. 표시된 경우, 탈이온수 또는 피오시아닌(100 mM) 또는 피오시아닌-아스코르브산 혼합물(pH 7, 1:2 및 1:20 비율로 2시간 동안 배양)을 EtBr-DNA 복합체에 첨가하고 형광 신호의 변화를 기록했습니다. 대조군(EtBr-DNA)에 대한 형광 신호의 변화는 피오시아닌 또는 피오시아닌-아스코르브산 혼합물이 DNA에서 EtBr을 대체하고 피오시아닌이 DNA에 결합하는 능력을 결정합니다.

녹농균 분리균 및 성장 조건

이 연구에서 사용된 P. aeruginosa 분리균은 LasR 분석 을 위한 P. aeruginosa MH602 las B:: gfp (ASV), RhlR 분석을 위한 PAO1 rhlA::gfp, PqsR 분석을 위한 PAO1 pqs A:: gfp 였으며, 임상 분리균인 DFU-53(당뇨성 다리 상처 궤양, Liverpool Hospital, NSW, Australia), wound-364,077(두부 상처), 요로 분리균인 UTI-15와 UTI-62(Royal Prince Alfred Hospital, NSW, Australia)였습니다. 이 분리균은 25% DMSO가 포함된 -80°C 냉동고에 보관했습니다. 이 연구에서는 스톡 25 μL를 Tryptone soy(TS, Oxoid, Australia) 한천 평판에 직접 도말하여 37°C에서 24시간 동안 배양했습니다. 단일 콜로니를 5 mL의 풀 스트렝스 Mueller Hinton Broth(MHB)에 접종하고 37°C에서 24시간 동안 흔들면서(100 rpm) 배양했습니다. 분리균의 경우, MH602 las B:: gfp (ASV), PAO1 rhl A ::gfp 및 PAO1 pqs A:: gfp를 30 μg/mL 겐타마이신이 존재하는 상태에서 배양했습니다.

아스코르브산과 Fu-30이 녹농균 QS 및 성장 에 미치는 영향

MHB에서 성장시킨 후, P. aeruginosa 분리주 MH602 las B:: gfp (ASV), PAO1 rhl A ::gfp 및 PAO1 pqs A:: gfp를 M9 최소염 배지(Sigma-Aldrich, Sydney, NSW, Australia)에서 1:4의 비율로 희석했습니다. M9 배지는 낮은 자가형광을 가지고 있기 때문에 선택되었고, 이 연구에서 사용된 MHB:M9의 1:4 비율은 P. aeruginosa 의 성장에 이상적이며 동시에 6웰 플레이트(Corning Corp., Corning, NY, United States)에 총 5mL의 부피에 대해 MHB의 자가형광 간섭을 최소화하여 GFP 생성을 측정할 수 있었습니다. 이때 광학 밀도(OD _600nm )는 0.1±0.02이고 아스코르브산(10, 20, 30, 40, 50 및 70mM), Fu-30(10, 20, 30, 40, 50 및 100μM) 또는 아스코르브산-Fu-30의 조합(10mM + 10μM, 10mM + 20μM, 20mM + 10μM)이 존재하거나 존재하지 않는 상태에서 이루어졌습니다. 20 mM + 20 μM. 미처리 대조군과 용매의 영향을 시험하기 위해 Fu-30 대신 PBS와 DMSO(각각의 Fu-30 농도와 동일)를 사용했습니다. 마지막으로 희석된 박테리아 배지 200 μL를 96웰 플레이트(Corning Corp., Corning, NY, United States)에 분주하고 100 rpm으로 궤도 진탕하면서 37°C에서 배양했습니다. 수용체 단백질인 LasR, RhlR 및 PqsR을 통한 GFP 생성 과 박테리아 성장을 8시간 동안 매시간 모니터링한 다음 24시간 후에 플레이트 리더를 사용하여 LasR, RhlR 및 PqsR의 경우 Ex _{488 nm} 및 Em _{515 nm 에서 형광을 측정하고 박테리아 성장의 경우 OD 600 nm에서} 형광 을 측정했습니다. LasR, RhlR 및 PqsR 발현을 정량화하기 위해 각 시점에서 측정한 GFP 형광 값을 해당 OD _{600 nm} 흡광도로 나누었습니다. 그래프는 GFP/OD 대 시간(시간)으로 표시되었습니다.

아스코르브산-Fu 30 조합으로 배양 한 녹농균 으로부터 피오시아닌 추출

P. aeruginosa 분리균 MH602, PAO1, DFU-53, wound, UTI-62, UTI-15를 아스코르브산이 있거나 없는 상태에서 20% MHB에서 24시간 동안 배양했습니다. 24시간 후, 배양액을 25°C에서 10분 동안 4500×g로 원심분리하여 상층액에서 세균 세포 펠릿을 분리했습니다. 상층액의 피오시아닌 양은 클로로포름-HCl 검정법을 사용하여 정량화했습니다.

아스코르브산-Fu-30이 녹농균 용혈소 활성 에 미치는 영향

P. aeruginosa 분리균은 아스코르브산(20 mM) + Fu-30(20 μM)의 존재 또는 부재 하에 24시간 동안 배양했습니다. 세포가 없는 상층액은 25°C에서 10분 동안 4500 × g로 원심분리하여 수집한 다음 0.22 μm Millex-GP 주사기 필터(Millipore, Merck, Australia)로 여과했습니다. 동시에, 세척된 토끼 혈액은 50 mL 팔콘 튜브에서 토끼 혈액(Equicell, Australia) 2 mL와 PBS 13 mL를 섞은 다음 원심분리(25°C에서 5분 동안 4,500 × g)하여 준비했습니다. 원심분리 후 상층액을 버리고 원심분리로 PBS로 세척 절차를 3번 반복했습니다. 마지막으로, 세척된 토끼 혈액 펠릿을 추가 용혈소 검정을 위해 5 mL PBS에 현탁했습니다. 세포가 없는 상층액을 세척한 토끼 혈액 100 μL에 0.25:1, 0.5:1 및 1:1의 비율로 첨가했습니다. 그런 다음 이를 37°C에서 60분 동안 흔들면서(100 rpm) 배양했습니다. 25°C에서 4500 × g로 10분 동안 원심 분리한 후, 상층액 100 μL를 96웰 플레이트로 옮기고 520 nm에서 흡광도를 측정하여 적혈구의 용혈을 정량화했습니다.

아스코르브산-Fu-30이 녹농균 부착 및 바이오필름 형성 에 미치는 영향

영어 : Pseudomonas aeruginosa 분리균을 광학 밀도(OD _{600 nm} ) = 0.1 ± 0.02로 접종하고 아스코르브산(20 mM) + Fu-30(20 μM)의 존재 또는 부재 하에 20% MHB에서 37°C에서 2, 8, 24시간 동안 흔들면서(100 rpm) 6웰 플레이트에서 성장시켰습니다. 해당 시점에서 상층액을 제거하고 플레이트를 PBS로 세 번 세척하여 느슨하게 부착된 박테리아를 제거했습니다. 웰에 있는 박테리아의 이미지는 광학 현미경(Zeiss AxioScope.A1 FL, LED, Jena, Germany)을 사용하여 캡처했고 박테리아 부착의 총 면적은 Fiji Image J 소프트웨어를 사용하여 정량화했습니다. 이미징 후, 크리스탈 바이올렛(0.05% w/v)을 웰에 첨가하고 37°C, 100 rpm에서 밤새 배양했습니다. 크리스탈 바이올렛 염료를 웰에서 제거한 다음 PBS로 웰을 세 번 세척하여 과도한 크리스탈 바이올렛을 제거했습니다.웰을 37°C에서 30분간 건조한 다음 80% 에탄올 1,000 μL(크리스탈 바이올렛을 용해)를 첨가하고 흔들면서(100 rpm) 37°C에서 60분간 더 배양했습니다.용해된 크리스탈 바이올렛을 새로운 96웰 플레이트로 옮기고 OD _{550 nm} 에서 흡광도를 기록했습니다 .아스코르브산과 Fu-30이 없는 상태에서 형성된 바이오필름을 대조군(바이오매스 100%)으로 사용했고, 아스코르브산(20 mM) + Fu-30(20 μM) 조합 처리 바이오필름으로 인한 바이오필름 바이오매스 변화를 대조군과 비교하여 평가했습니다.

아스코르브산 + Fu-30이 녹농균 집락형성능 에 미치는 영향

Pseudomonas aeruginosa 분리균은 아스코르브산(20 mM) + Fu-30(20 μM)의 존재 또는 부재 하에 2, 8 및 24시간 동안 배양한 다음 PBS로 세척했습니다(위에서 설명한 대로). 부착된 박테리아는 5 mL PBS에서 멸균 수술용 칼로 표면 위를 30번 긁어서 배양 용기에서 제거했습니다. 박테리아 현탁액을 PBS로 연속 희석하고 TS 아가에서 37°C에서 24시간 동안 배양했습니다. CFU/mL 수는 아가 플레이트의 개별 콜로니를 세어 아스코르브산-Fu 30의 존재 또는 부재 하에 성장한 표면에 부착된 박테리아의 수를 확인하여 계산했습니다.

토브라마이신이 미리 확립된 바이오필름에 미치는 영향

영어: Pseudomonas aeruginosa 임상 분리균인 DFU-53 및 UTI-62 바이오필름을 6웰 플레이트에서 20% MHB에서 아스코르브산(20 mM) + Fu-30(20 μM)의 존재 또는 부재 하에 24시간 동안 성장시킨 다음 PBS로 3번 세척했습니다. 그런 다음 부착된 바이오필름을 PBS에서 토브라마이신(1, 5 및 10 × MIC, P. aeruginosa DFU-53 및 UTI-62의 MIC 값은 보충 자료 에 언급됨 )으로 처리하고 37°C, 100 rpm에서 4시간 동안 배양했습니다. 4시간 후, 토브라마이신으로 처리한 바이오필름을 PBS로 두 번 세척한 다음 바이오필름 바이오매스 정량화를 위해 크리스탈 바이올렛으로 염색하거나 부착된 세포를 긁어내어 TSB 한천에서 배양했습니다(위에 설명한 대로).

인간 포피 섬유아세포(HFF-1) 수확

HFF-1(15-17번째 통과)은 태아우시혈청(12% v/v), 페니실린(100 IU/mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)이 보충된 DMEM 배지에서 37°C, 5% (v/v) CO ₂ 에서 배양하고 0.12% v/v 트립신-EDTA를 사용하여 95% 합류점에서 수확했습니다. 배지에 트립신 1:1 v/v로 담금한 후 세포를 수집하여 50 mL 팔콘 튜브로 옮긴 다음 원심분리했습니다(6분, 4,500 × g, 20°C). 상층액을 흡인하고 HFF-1 세포 펠릿을 추가 실험을 위해 보충된 DMEM 배지에 현탁했습니다. HFF-1 세포를 6웰 플레이트에 ¹⁰⁵ 개/mL 의 밀도로 도말하고 , 정적 조건 하에 5% (v/v) CO ₂ 에서 37°C에서 배양했습니다 . 새로 보충된 DMEM 성장 배지를 이틀에 한 번씩 첨가하여 세포의 밀도가 95%~100%에 도달할 때까지 배양했습니다(광학 현미경으로 검증).

인간 포피섬유아세포(HFF-1)에 대한 아스코르브산-Fu-30의 효과 분석

HFF-1 세포독성은 British Standard( ISO 10993-5:2009, 2009 )-직접 접촉 검정법을 사용하여 평가했습니다.95%-100% 합류에서 세포에 1mL의 성장 배지를 보충한 다음, 새로 만든 항생제 필터 디스크(6mm, Whatman GE Healthcare, Sydney, Australia)를 50μL의 조합물로 함침(주위 온도에서 2시간 동안 배양)시켜 웰 중앙에 두었습니다.필터 디스크는 50μL의 시험 화합물을 6mm 항생제 여과지 디스크에 직접 첨가하고 디스크가 시험 화합물을 흡수할 수 있도록 실온(25±1°C)에서 2시간 동안 배양하여 준비했습니다.그런 다음 플레이트를 5%(v/v) CO ₂ 에서 37°C에서 24시간 동안 배양했습니다 . 24시간 후, 필터 디스크와 세포 성장 배지를 제거하고 1mL 멸균 PBS로 교체했습니다.HFF-1 세포의 세포 형태와 합류는 광학 현미경으로 평가했습니다.대조군의 경우, 0.9% w/v NaCl 50 μL를 함유한 필터 디스크와 100% DMSO(세포 사멸을 유발하는 양성 대조군) 50 μL를 함유한 또 다른 필터 디스크를 사용했습니다.ISO 10993-5:2009(2009) 에 따라 , 세포 생존율이 80% 이상(등급 0)으로 유지되면 시험 화합물은 비세포독성으로 간주되었고, 세포 용해가 50% 이하(등급 2)이면 경미한 것으로 간주되었습니다.HFF-1 세포의 생존율은 또한 레자주린 검정법을 사용하여 정량화했습니다. HFF-1 대사 생존력을 측정하기 위해 HFF-1 세포에 1mL의 멸균 PBS를 간단히 첨가하여 HFF-1 세포를 한 번 세척한 다음 실온에서 1분간 배양한 다음 PBS를 피펫으로 빼내고 즉시 0.05% w/v 레자주린 용액 1mL(멸균 PBS에 레자주린을 녹여 미리 제조하고 4°C 냉장고에 보관하여 필요에 따라 사용)로 대체하여 5%(v/v) CO 2 에서 37°C에서 배양하여 24시간 염색했습니다 _{. 24시간 배양 후 HFF-1의 형광 강도를 Tecan 플레이트 리더를 사용하여 Ex 544 nm} 및 Em _{590 nm} 에서 측정했습니다 .

피오시아닌-아스코르브산 복합체의 NMR

NMR 분광법은 아스코르브산(1,000 μM)을 첨가했을 때 피오시아닌(pH 7, 100 μM) 구조에 명확한 변화가 있음을 보여줍니다. 2시간 후, 모든 특징적인 피오시아닌 NMR 신호가 넓어졌고, 6.6–7.0 ppm(피오시아닌의 가능한 불순물) 주변의 작은 피크는 그대로 유지되었고, 5.2 ppm 주변에 새로운 피크가 나타났습니다(그림 2). 피오시아닌 피크(약 6.2 및 6.4 ppm)가 완전히 사라지고 새로운 NMR 신호 세트가 나타나는 것은 72시간 후(pH 7)에 새로운 종이나 피오시아닌-아스코르브산 부가물이 형성된 결과입니다. pH를 제어하지 않은 경우, 2시간 후에 NMR 신호에서 유사한 변화가 나타났지만, 72시간 후에 약 9.2 및 7.7 ppm에서 두 개의 추가 신호가 나타났습니다. 이러한 새로운 신호의 정확한 정체성을 확인하려면 더 자세한 분광 조사가 필요합니다. 그럼에도 불구하고 아스코르브산이 존재할 때 피오시아닌의 구조적 변화(그림 2)는 이러한 NMR 실험으로 확인되었습니다. 아스코르브산을 시트르산(pH 7)으로 대체했을 때, 유사한 조건에서 72시간 배양한 후에도 그러한 변화는 관찰되지 않았습니다.

 

그림 2

^{피오시아닌 방향족 영역에서 피오시아닌에 대한 아스코르브산(AA)의 영향에 대한 1} H-NMR 분석. 피오시아닌의 방향족 부분은 산성 및 생리적 pH에서 아스코르브산과 복합체를 형성할 때 특징적인 NMR 신호에서 정확한 변조를 보였다. 8.1 ppm에서 새로운 피크가 형성되고 6.2 및 6.4 ppm 부근에서 피오시아닌 피크가 사라진 후 72시간 후의 주요 y는 새로운 종 또는 피오시아닌-아스코르브산 부가물의 구성을 나타낸다.

피오시아닌-아스코르브산 상호작용에 대한 밀도 함수 이론 예측

밀도 함수 이론(DFT)은 (i) 피오시아닌의 -C=O와 아스코르브산의 -CH ₂ OH 단위, (ii) 피오시아닌의 -C=O와 아스코르브산의 가장 산성인 -OH 단위 사이에 두 가지 가능한 H-결합 상호 작용을 예측했습니다.그림 3). 이 두 구조는 모두 Gaussian 09 프로그램에 구현된 함수인 B3LYP( Becke, 1993 )와 모든 원소에 대한 6-31G(d,p) 기반 세트를 사용하여 DFT로 최적화(제한 없음)되었으며, 수용성 용매화(SMD) 모델( Kromann et al., 2018 )을 적용했습니다. 이 계산에 따르면 두 방향 모두 거의 유사한 에너지를 가지며 아스코르브산의 –CH ₂ OH 에서 H-결합(결합 거리 1.73 Å)을 약간(1.27 kJ/mol) 선호합니다 (그림 3A) 다른 것(1.63 Å 결합 거리)보다 (그림 3B). 분산 보정 기능이 있고 파이-파이 스태킹 상호작용(수용성 용매화에 대한 SMD 모델 포함 제한 없음)에 대해 더 정확한 것으로 보고된 또 다른 기능인 B97D3( Antony 및 Grimme, 2006 )은 아스코르브산의 -CH ₂ OH 에서 H-결합(결합 거리 1.88Å)을 식별했습니다.그림 3C)는 다른 것(1.71 Å 결합 거리)보다 13.01 kJ/mol만큼 더 유리했습니다.그림 3D). 전체 계산은 보충 그림 S4 에서 확인할 수 있습니다 .

 

그림 3

DFT는 피오시아닌과 아스코르브산 사이의 가능한 H-결합 상호작용의 구조를 최적화했습니다. AD는 피오시아닌과 아스코르브산 사이의 H-결합 가능성을 나타냅니다.

아스코르브산이 피오시아닌 수율에 미치는 영향

피오시아닌의 양은 아스코르브산과 혼합하여 2시간 또는 72시간 동안 배양했을 때 현저히 감소했습니다.그림 4A). 수용액 혼합물이 중성 pH로 완충되었을 때는 덜 두드러졌지만 시간과 농도에 따라 달랐습니다. 이러한 결과는 아스코르브산이 중성 수용액 환경에서 피오시아닌과 반응한다는 것을 시사합니다.

 

그림 4

피오시아닌을 산성 또는 중성 pH에서 아스코르브산(AA)과 2시간 및 72시간 동안 배양한 결과 피오시아닌 회수율이 급격히 감소했습니다. (A) 완충된 버전보다 산성 아스코르브산에서 영향이 더 크고 빠릅니다. ^* 차이가 피오시아닌 50 μM과 비교하여 통계적으로 유의미함을 나타냅니다( p < 0.05). 모든 실험은 n  = 3 반복  으로 수행되었습니다 . (B) 원형 이색성은 피오시아닌과 페나진이 DNA에 끼어드는 것을 보여줍니다. 220 nm 및 280 nm에서 피오시아닌 피크에서 관찰된 과염색 효과에서 알 수 있습니다. (C) 형광 분광 분석은 아스코르브산이 피오시아닌이 DNA에 결합하는 것을 억제함을 보여줍니다. EtBr 치환법은 피오시아닌이 EtBr을 치환하고 DNA와 결합(빈 원)하고 형광 강도가 305까지 낮아짐(왼쪽 패널)을 보여줍니다. AA가 존재하면 Pyo-AA 복합체는 피오시아닌이 DNA에 결합하는 것을 방해하여 형광 값이 425로 높아집니다(오른쪽 패널).

아스코르브산은 DNA에 피오시아닌이 결합하는 것을 억제합니다.

원형 이색성 스펙트럼은 dsDNA 결합과 일치하는 피오시아닌과 페나진의 존재 하에 특징적인 dsDNA 피크의 이동을 나타냈습니다.그림 4B). mdeg에서 가장 두드러진 변화는 209, 220 nm 및 280 nm에서 관찰되었습니다. 데이터는 피오시아닌과 페나진이 DNA 구조에서 국소적 조절을 생성한다는 것을 시사합니다(그림 4B). 형광 분광법 (그림 4C)는 피오시아닌이 존재할 때 dsDNA에 결합된 EtBr의 형광 최대값이 세기가 감소한다는 것을 보여주었는데, 이는 피오시아닌이 삽입된 EtBr을 대체하는 것과 일치합니다. 아스코르브산이 존재할 때 피오시아닌은 형광 세기를 감소시키지 않았으며, 이는 아스코르브산이 복합체화를 통해 피오시아닌 삽입을 방해하는 것과 일치합니다. 완충되지 않은 용액에서 아스코르브산은 DNA 단편화를 일으킬 수 있다는 점에 유의하십시오( Erdem et al., 1994 )( 보충 그림 S5D ); 따라서 모든 실험은 중성 pH에서 수행되었습니다.

아스코르브산과 Fu-30의 조합은 QS 조절 수용체의 기능을 억제했습니다.

개별 화합물 아스코르브산과 알려진 QS 억제제 Fu-30, 그리고 이 둘의 조합은 QS 반응 조절자 LasR, RhlA 및 PqsR 매개 GFP 생성을 억제했습니다.그림 5). 최대 8시간까지 Fu-30은 GFP 생성을 억제하는 데 아스코르브산보다 효과적이었습니다. 그러나 24시간이 지나면 아스코르브산이 Fu-30보다 효과적이 되었습니다. 흥미롭게도 아스코르브산과 Fu-30의 조합은 특히 가장 높은 농도(아스코르브산 20mM + Fu-30 20μM)에서 모든 시간 지점에서 세 QS 수용체 모두에 대해 Fu-30과 아스코르브산만을 처리한 경우에 비해 GFP 생성이 가장 크게 감소했습니다.

 

그림 5

아스코르브산(AA)과 푸라논-30(Fu-30) 및 이 둘의 조합이 P. aeruginosa 쿼럼 감지에 미치는 영향. MH602는 lasR 시스템(왼쪽)의 효과를 연구하는 데 사용되었고, PAO1은 rhlA(중앙)와 pqsR(오른쪽)을 연구하는 데 사용되었습니다. Fu-30은 최대 8시간까지 GFP 생성이 감소했고 AA만 첨가한 경우 모든 시점에서 GFP 생성이 상당히 감소했습니다. AA와 Fu-30의 조합은 세 가지 QS 시스템 모두의 활성이 가장 크게 감소했으며, 특히 AA 20 mM + Fu-30 20 μM에서 감소했습니다. 모든 실험은 3회 반복하여 수행되었습니다. ^*는  대조군과 비교했을 때 p < 0.05를 나타내고 , ^** 는  Fu-30 단독과 비교했을 때 p < 0.05를 나타내고 , ^***는  AA 단독과 비교했을 때 p < 0.05를 나타내고, ^# 은  Fu-30 단독의 농도 증가 간의 비교인 p < 0.05를 나타내고 , ^{##는 AA 단독의 농도 증가 간의 비교인} p  < 0.05를 나타냅니다.

아스코르브산과 Fu-30의 조합은 피오시아닌 생성을 억제했습니다.

아스코르브산과 Fu-30의 조합이 존재하거나 존재하지 않는 상태에서 24시간 동안 배양된 P. aeruginosa 분리균 에 의한 피오시아닌 생성 분석 (그림 6A). 임상 및 실험실 분리물 모두에서 조합의 존재 하에 성장했을 때 피오시아닌 수율이 상당히 감소했습니다. 처리하지 않았을 때, 광학 밀도로 표시된 P. aeruginosa 균주의 피오시아닌 생성은 (OD _{520 nm} ) 0.04에서 0.9 범위였으며, UTI-62가 가장 높은 피오시아닌 생성을 보였습니다. 반면 아스코르브산과 Fu-30의 조합으로 처리했을 때 모든 균주에서 피오시아닌 생성(OD _{520 nm} )이 0.018(그림 6B).

 

그림 6

콤보(AA(20 mM)와 Fu-30(20 μM)의 조합)가 P. aeruginosa 독력 인자 피오시아닌과 용혈소에 미치는 영향. (A) 콤보만 박테리아 배양에서 녹색 색상(피오시아닌 생성의 지표)이 사라짐을 보여줍니다. (B) 콤보는 모든 P. aeruginosa 균주/분리주에서 피오시아닌 생성을 현저히 감소시켰습니다. (C) 콤보는 또한 모든 임상 분리주에서 용혈소 활성(사용된 상층액의 최고 용량인 100 μL에서)을 현저히 감소시켰습니다. 실험은 3회 반복하여 수행되었습니다. ^* p < 0.05를 나타냅니다  .

복합치료는 용혈소 활동을 억제했습니다.

그림 6C실험실 균주 MH602와 PAO1은 흡광도(OD545 _nm )가 약 0.1(기준선과 유사)이기 때문에 용혈소를 생성하지 않았지만 임상 분리균은 용혈소를 생성했습니다. 아스코르브산과 Fu-30의 조합이 존재하는 환경에서 성장했을 때 임상 분리균의 용혈 활성이 감소했으며, 감소는 UTI 분리균에서 더 두드러졌고 1:1 부피 비율(즉, 100 μL 혈액: 100 μL P. aeruginosa 무세포 상층액)에서 나타났습니다. 반면, P. aeruginosa 무세포 상층액과 토끼 혈액 의 비율이 낮을 때는 용혈 활성이 나타나지 않았습니다.

복합치료는 초기 접착력을 감소시켰습니다.

아스코르브산과 Fu-30의 조합이 존재하는 환경에서 성장했을 때, 특히 모든 분리균에 대해 8시간 배양 후 박테리아의 부착이 현저히 감소했습니다.그림 7A,​,비).비).그림 7C,​,디디2시간과 8시간 배양 후의 UTI-62의 대표적 이미지를 보여줍니다.

 

그림 7

복합 처리가 P. aeruginosa 접착 에 미치는 영향 . (A) P. aeruginosa 의 접착 면적은 모든 분리주에서 2시간에서 8시간까지 상당히 증가했습니다. (B) 복합 처리가 있는 경우 박테리아의 총 접착 면적은 정체되었고 값은 2시간과 8시간 동안 동일하게 유지되었습니다. (C,D) 미세한 이미지는 2시간과 8시간 시점에서 P. aeruginosa 분리주(UTI-62) 접착의 예를 나타냅니다. 척도 막대 = 50μm. ^* 차이가 처리되지 않은 대조군과 비교하여 통계적으로 유의미하다는 것을 나타냅니다( p < 0.05). 모든 실험은 n  = 3 생물학적 반복  으로 수행되었습니다 .

복합 치료는 녹농균 바이오 필름-바이오매스를 감소시켰습니다.

모든 시점에서 아스코르브산-Fu-30 조합의 존재 하에 배양된 P. aeruginosa는 ​​결정 바이올렛 염색이 현저히 적게 나타났습니다.그림 8A), 조합이 초기 바이오필름 형성 및 성숙을 방해한다는 것을 시사합니다. 8시간 및 24시간 배양 후 분리체 DFU-53 및 UTI-62의 대표적 이미지가 제공됩니다.그림 8B. 마찬가지로, 조합의 존재 하에 성장했을 때 2시간(3-4 log ₁₀ 감소), 8시간(3-4 log ₁₀ 감소) 및 24시간(1-3 log _{10 감소) 배양 후 모든} P. aeruginosa 분리 균의 집락 수가 감소했습니다.그림 8C).

 

그림 8

2, 8 및 24시간 시점에서 P. aeruginosa 바이오필름 바이오매스 의 정량화 . (A) 콤보가 있는 경우 모든 분리주에서 바이오매스가 유의하게 적습니다 (A) . (B) 콤보 가 있는 경우 바이오필름이 자란 대조군과 비교하여 진한 크리스탈 바이올렛 염색을 유지하는 대조군을 보여주는 사진 이미지. (C) 콤보가 있는 경우 모든 시점에서 CFU/mL이 대조군보다 유의하게 적었습니다. ^* 대조군과 비교하여 차이가 통계적으로 유의미( p < 0.05)함을 나타냅니다. 모든 실험은 n  = 3 생물학적 반복  으로 수행되었습니다 .

아스코르브산과 Fu-30의 존재 하에 성장된 미리 확립된 바이오필름에 대한 토브라마이신의 영향

그림 9A,​,비비그림은 아스코르브산과 Fu-30을 24시간 동안 혼합하여 토브라마이신과 함께 배양한 바이오필름에서 얻은 크리스탈 바이올렛 데이터를 보여줍니다. 이 데이터는 아스코르브산과 Fu-30이 존재할 때 세포가 토브라마이신에 더 민감하다는 것을 시사합니다. 토브라마이신만 처리했을 때(1–10 × MIC) DFU-53과 UTI-62의 사전 설정된 바이오필름 바이오매스는 각각 50%–60%와 40%–50% 감소했습니다. 이에 반해 토브라마이신 처리가 두 가지를 혼합하여 배양한 바이오필름에 더 효과적이었으며, DFU-53(25%–32%)과 UTI-62(3%–17%) 모두 바이오매스가 상당히 감소했습니다.

 

그림 9

토브라마이신과 콤보 + 토브라마이신이 P. aeruginosa 의 사전 확립된 바이오필름에 미치는 영향 . (A–C) 사전 확립된 바이오필름에서 콤보 + 토브라마이신 처리(4시간)는 토브라마이신 단독 처리 (C) 에 비해 바이오필름 바이오매스 (A) , 크리스탈 바이올렛 염색 유지 (B) 및 CFU/mL에서 유의미한 감소를 보였습니다 . ^* 차이가 대조군과 비교하여 통계적으로 유의미( p < 0.05)함을 나타냅니다. 모든 실험은 n  = 3 생물학적 반복  으로 수행되었습니다 .

DFU-53 및 UTI-62 CFU/mL도 아스코르브산과 Fu-30이 존재하는 상태에서 성장한 바이오필름에 대해 토브라마이신으로 처리했을 때 상당한 감소를 보였습니다. 조합이 존재하는 상태에서 성장했을 때, CFU/ml의 감소는 무처리 대조군과 비교하여 1/2 MIC-10 MIC의 경우 3.5 log ₁₀ 에서 6.5 log _{10 사이였습니다. 반면 바이오필름이 조합 처리 없이 성장했을 때, 토브라마이신 처리가 0.2 log 10} 에서 3.5 log ₁₀ 사이의 더 작은 감소를 보였습니다 (그림 9C).