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저항 운동(RE)은 근육 단백질 합성(MPS)의 강력한 자극제이며, 반복적인 활동은 골격근 비대를 초래할 수 있습니다[ 1 ]. 그러나 일부 이전 동물 연구에서는 MPS가 운동 직후에 억제되거나 변하지 않는다고 제안했습니다[ 2 , 3 ]. 근육 단백질 분해(MPB)와 관련하여 RE 동안 증가하고 금식 상태에서 운동 후 최대 24시간 동안 높은 수준을 유지하는 것으로 보고되었습니다[ 1 , 4 ]. 이러한 조건에서 RE 후 초기 회복 단계에서 부정적인 근육 순 단백질 균형이 발생할 수 있습니다[ 4 ]. 따라서 운동 직후 영양 보충은 MPS를 증가시키고 회복 초기 단계에서 MPB를 억제하는 데 중요합니다. 단백질 보충은 운동 후 MPS를 증가시키기에 충분한 아미노산과 포유류 라파마이신 표적(mTOR) 신호 전달 경로를 활성화한다는 것이 일반적으로 받아들여집니다[ 5 – 7 ]. mTOR는 근육 수축, 아미노산(AA), 성장 인자의 상류 신호를 통합하여 단백질 번역 개시를 매개로 MPS를 자극하는 중심 키나제입니다. 따라서 RE를 한 번만 투여해도 mTOR 신호 전달 경로를 활성화할 수 있으며, 운동 후 단백질 보충제를 제공하면 더욱 강화할 수 있습니다. 흥미롭게도 Anthony와 동료들은 고강도 지구력 운동이 쥐의 운동 후 조기 회복 중에 근육 동화작용을 감소시키고 단백질 보충제는 합성 속도를 기저 수준으로 회복시킬 수 없다고 보고했습니다[ 3 ].
단백질 보충제에 탄수화물(CHO)을 첨가한 연구 결과에 따르면 탄수화물을 첨가하면 운동 후 근육 회복에 도움이 될 수 있는 것으로 나타났습니다[ 8 ~ 10 ]. 금식 상태에서 고강도 RE를 실시한 직후 인체는 인슐린 감소와 코르티솔, 에피네프린을 포함한 이화 호르몬 상승으로 인해 부분적으로 순 단백질 균형이 음수입니다. 수많은 연구에 따르면 인슐린은 포크 헤드 박스 3A(FOXO3A)[ 14 ]를 억제하여 MPB[ 11 ~ 13 ]에 대한 인슐린 억제 효과를 보여 강력한 항분화 효과가 있는 것으로 나타났습니다 . 인슐린은 또한 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(PI3k)를 활성화하여 mTOR 신호 전달 경로를 활성화합니다. 일부 시험관 연구에서는 인슐린이 근관 단백질 합성을 상당히 증가시키는 것으로 나타났지만[ 15 , 16 ], 생체 연구에서는 인슐린이 MPS에 미치는 긍정적 효과를 발견한 경우가 극소수에 불과 합니다[ 17 , 18 ]. 인슐린이 생체 내에서 MPS를 자극하는 데 효과적이지 않은 것은 인슐린이 혈액에서 AA를 제거함에 따라 AA 가용성이 부족하기 때문일 수 있습니다. 그러나 CHO와 단백질을 함께 섭취하면 충분한 농도의 AA를 공급하는 동시에 고인슐린혈증 상태를 촉진하여 운동 후 근육 단백질 축적을 극대화할 수 있습니다. 그러나 지금까지 MPS에 대한 CHO와 단백질/AA 보충제의 복합 효과를 조사한 연구에서는 일관되지 않은 결과가 보고되었습니다[ 10 , 19-21 ] . 따라서 이 연구의 주요 목적은 쥐 모델을 사용하여 유청 단백질(WP) 보충제에 CHO를 추가하면 WP만 첨가했을 때보다 운동 회복 초기에 MPS가 더 높아지는지 조사하는 것이었습니다. 본 연구에서는 또한 MPS를 증가시키고 MPB를 감소시키는 방식으로 신호 단백질의 인산화 상태를 조사했습니다. 저항 운동 후 CHO와 WP의 조합으로 보충하면 WP만 보충하는 것보다 더 나은 MPS를 얻을 수 있다는 가설이 세워졌습니다.
재료 및 방법
동물
80마리의 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 Charles River(매사추세츠주 윌밍턴)에서 생후 2개월에 구입했습니다. 쥐는 케이지당 2마리씩 수용했고 표준 실험실 사료(Prolab RMH 1800 5LL2, LabDiet, 미주리주 브렌트우드)와 물은 자유롭게 먹였습니다. 동물실의 온도는 21°C로 유지했고, 역인공 12:12시간 암흑-광 주기를 적용했습니다. 실험 절차는 오스틴에 있는 텍사스 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에서 승인했으며 미국 보건 인적자원부에서 발표한 실험 동물 사용 지침을 준수합니다. 우리는 식단과 운동을 엄격하게 조절하기 위해 Sprague-Dawley 쥐를 사용하기로 했습니다. 또한 이 쥐 모델은 유전적 동질성이 높아 운동 반응의 분산을 줄였습니다.
운동에 익숙해지다
1주일의 적응 후, 쥐들은 운동 프로토콜에 익숙해지기 위해 사다리 오르기를 3회 반복했습니다. 각 세션은 4회의 시도로 구성되었으며 1일 간격으로 분리되었습니다. 쥐들은 이 익숙해지는 기간 동안 무게를 지니지 않았습니다. 사다리는 높이 1m이고 경사도는 85°이며 2cm 그리드 단계가 있습니다. 초기 익숙해진 후, 쥐들은 각 세션 사이에 1일 간격으로 3회의 등반 연습 세션을 완료했으며, 체중의 각각 50%, 60% 및 70%를 꼬리에 부착했습니다. 무게는 폼 테이프(3M Conan)와 벨크로 스트랩으로 꼬리에 고정했습니다. 쥐들은 병 브러시로 꼬리를 가볍게 두드려서 올라가도록 했습니다.
실험 프로토콜
밤새 단식한 후, 쥐들은 우리의 이전 연구[ 22 ]에서 설명한 대로 급성 저항 운동을 받았습니다.간단히 말해, 쥐들을 등반 사다리에 올려놓고 체중의 75%에 해당하는 무게를 꼬리에 매고 10번 올라갔습니다.각 등반 사이에 2분간 휴식을 취했습니다.운동 프로토콜을 완료한 후, 각 쥐를 따로 수건으로 감쌋습니다.꼬리 끝에서 0.7ml의 혈액 샘플을 채취했습니다.운동 직후, 동물들은 위약(PLA = ddH 2 O), 유청 단백질(WP = 0.375g/kg), 또는 탄수화물과 WP(CP = 1.2g/kg 덱스트로스+0.375g/kg WP) 보충제를 경구 투여받았습니다.20마리의 쥐는 앉아서만 있는 대조군(SED)으로 사용되었고 ddH 2 O를 경구 투여받았습니다.모든 쥐는 운동에 익숙해지기 전에 무작위로 치료에 배정되었습니다. 각 치료군의 쥐는 안락사 시간에 따라 세분되었으며, 안락사는 위관 영양 공급 후 1시간 또는 2시간에 이루어졌습니다(n = 10). 위관 영양 공급 후 쥐를 각각의 우리로 돌려보냈습니다. 위관 영양 공급 후 30분 또는 90분에 PBS(pH = 7.4)에 용해한 푸로마이신 0.04μmol/g 체중을 쥐의 복강 내 주사로 투여하여 표면 감지 번역(SUnSET) 절차에 의한 근육 단백질 합성 속도를 확인했습니다. 이 절차는 전통적인 방사성 동위 원소 기술에 대한 유효한 대안으로 입증되었지만, 푸로마이신 축적에 의한 MPS 측정은 간접적이고 반정량적입니다[ 23 ].
약 20분 후, 푸로마이신 주사 후 쥐에게 펜토바르비탈 나트륨(체중 1kg당 75mg)을 복강내 주사하여 마취시켰다. 두 번째 혈액 샘플을 채취한 후, 위관 영양 공급 후 1~2시간에 굽힘엄지장근(FHL)을 절제했다. 이 수술 과정 동안 쥐의 호흡 패턴과 반응성을 지속적으로 모니터링했다. 쥐가 절개에 반응하여 어떤 움직임을 보이면 수술을 일시적으로 중단하고 추가 마취를 실시했다. FHL은 약 90%의 II형 섬유를 포함하고 있으며, 그 중 대부분은 IIx형 섬유이다[ 24 ]. FHL은 사다리 오르기 중 가장 반응성이 좋은 근육이기 때문에 분석에 선택되었다[ 25 ]. FHL을 제거한 후, 쥐는 펜토바르비탈 나트륨(체중 1kg당 65mg)을 심장 주사하여 안락사시켰다. 우리 연구에 참여한 쥐들은 모두 건강했고 사다리 오르기, 급이, 퓨로마이신 주사, FHL 제거 수술을 포함한 모든 실험 절차를 사고 없이 성공적으로 완료했습니다.
혈액 분석
모든 혈액 샘플은 Sorvall RC-6 원심분리기(Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA)에서 FS-20 마이크로튜브 로터로 4°C에서 10분 동안 3,000g에서 원심분리했습니다. 원심분리 후, 정제된 혈장 샘플은 나중에 포도당, 인슐린, 코르티코스테론, 성장 호르몬(GH) 및 인슐린 유사 성장 인자(IGF)-1을 분석하기 위해 -80°C에 보관했습니다. 혈장 포도당은 포도당 산화효소와 변형된 Trinder 색상 반응(no. 315, Sigma Chemical, St. Louis, MO)을 사용하는 비색법을 사용하여 결정했습니다. 혈장 인슐린은 CV<10%인 방사면역측정 키트(Millipore Corporation, Billerica, MA)를 사용하여 측정했습니다. 코르티코스테론 농도는 CV<10%(Enzo life sciences Inc. Ann Arbor, MI. Cat ADI-900-097)의 효소 결합 면역 흡착 검사 키트(ELISA)로 결정했습니다. 혈장 GH(Millipore Corporation, Billerica, MA)와 IGF-1(Immunodiagnostic Systems Inc., Scottsdale, AZ)은 CV<10%의 ELISA 키트를 사용하여 측정하고 450nm와 630nm의 이중 파장에서 읽었습니다.
웨스턴 블롯 분석
면역 블롯 분석은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[ 22 ]. 간단히 말해서, ~50mg의 근육을 얼음처럼 차가운 균질화 완충액(20mM HEPES, 2mM EGTA, 50mM 불화나트륨(NaF), 100mM 염화칼륨(KCl), 0.2mM EDTA, 50mM 글리세로포스페이트, 1mM DL-디티오트레이톨(DTT), 0.1mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF), 1mM 벤자미딘 및 0.5mM 오르토반데이트나트륨(Na2VO4 ) ) 에서 유리 조직 분쇄기 유봉(Corning Life Sciences, Lowell, MA; Caframo Stirrer Type RZR1, Wiarton, Ont. Canada)을 사용하여 습윤 중량 근육의 1:8 희석액으로 균질화했습니다. 균질물을 4°C에서 10분 동안 14,000g로 원심분리한 후 상층액을 취해 Lowry [ 26 ]에 따라 총 단백질을 측정하고 western blot을 통해 단백질 합성과 지정된 세포 신호 단백질의 인산화를 측정했습니다. 모든 상층액은 분석할 때까지 -80°C에 보관했습니다.
Western blot의 경우, 단백질 60μg을 함유한 상층액 샘플을 Laemmli 샘플 완충액(125mM Tris, 20% 글리세롤, 20% SDS, 0.25% 브로모페놀 블루 및 β-머캅토에탄올, pH 6.8)과 동일한 양으로 혼합하고 95°C에서 15분간 끓여 근육 단백질을 변성시켰습니다[ 27 ]. 그런 다음, 샘플을 10–15% 분리 겔을 사용하여 130V에서 90분간 또는 90V에서 2.5시간 동안 SDS-PAGE(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA.)에 적용했습니다. 그런 다음 분리된 단백질을 습식 전이 장치(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA.)를 사용하여 90V에서 90분 동안 니트로셀룰로스 멤브레인(기공 크기: 0.45μm; GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA.)으로 전기적으로 전이시켰습니다. 전이가 완료되었는지 확인하기 위해 Ponceau S.(0.5% 아세트산에 0.1%)를 사용했습니다. 그런 다음 멤브레인을 0.06% Tween20(TTBS)이 포함된 Tris 완충 식염수(TBS)로 세척하여 Ponceau S. 염색을 제거한 다음 멤브레인을 TTBS(차단 완충액)에 넣은 7% 무지방 우유로 실온(RT)에서 1시간 동안 차단했습니다. 그런 다음 멤브레인을 적절한 1차 항체와 함께 4°C에서 밤새 배양했습니다. 표적 인산화 단백질은 mTOR(Ser2448), 70kDa 리보솜 단백질 S6 키나제(p70S6k)(Thr389), 리보솜 단백질 S6(rpS6)(Ser235/236), 4E 결합 단백질 1(4E-BP1)(γ 동형), 단백질 키나제 B(Akt)(Ser473), 글리코겐 합성효소 키나제(GSK)-3α/β(ser21/9), 진핵 개시 인자 2(eIF2)-Bɛ(ser539), 포크헤드 박스(FOXO) 3A(Ser318/321), 5' 아데노신 모노포스페이트-활성화 단백질 키나제(AMPK)(Thr172)였습니다. 알파-튜불린(α-튜불린)은 내부 로딩 대조군으로 사용되었습니다. Goodman et al.에 따르면 근육 단백질 합성을 감지하기 위해 항푸로마이신 항체가 사용되었습니다. [ 23]. 항-p-eIF2Bɛ 및 항-푸로마이신 항체는 EMD 밀리포어 코퍼레이션(EMD 밀리포어 코퍼레이션, 시카고, IL)에서 구입했습니다. 다른 모든 항체는 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology, 베벌리, MA)에서 구입했습니다. 하룻밤 동안 1차 항체를 프로빙한 후, 모든 막을 TTBS로 5분, 3회 세척했습니다. 항-푸로마이신 항체로 배양한 막을 HRP-접합 2차 항-마우스 IgG(EMD 밀리포어 코퍼레이션, 시카고, IL)와 함께 배양했습니다. 다른 모든 막을 HRP-접합 2차 항-토끼 IgG(Cell Signaling Technology, 베벌리, MA)와 함께 배양했습니다. 5분씩 3회 더 세척한 후, 막을 제조업체의 지침(Perkin Elmer, 보스턴, MA)에 따라 증강 화학 발광(ECL)으로 시각화했습니다. 모든 막을 벗겨내어 내부 로딩 대조군으로 α-튜불린을 다시 프로빙했습니다. 모든 웨스턴 블롯은 재현성(CV<8%)을 보장하기 위해 각 근육 샘플에 대해 중복으로 수행되었습니다. 그런 다음 ChemiDoc 시스템(Bio-Rad, Hercules, CA)의 전하 결합 소자 카메라를 사용하여 이미지를 캡처했습니다. 각 밴드의 강도는 Quantity One 분석 소프트웨어(Bio-Rad)로 정량화하고 표준의 백분율로 표현했습니다.
무료 푸로마이신 농도 분석
전구체인 유리 푸로마이신은 근육에 전달되어 신생 펩타이드 사슬에 통합될 수 있습니다. 유리 푸로마이신의 측정은 동일한 샘플에서 웨스턴 블롯 분석에서 얻은 MPS 값을 정규화하는 데 사용되었습니다. 분석은 약간의 수정을 거쳐 이전에 설명한 대로 [ 23 ] 수행되었습니다. 약 30mg의 근육을 유리 조직 분쇄기 유봉(Corning Life Sciences, Lowell, MA; Caframo Stirrer Type RZR1, Wiarton, Ont. Canada)을 사용하여 습중량 근육의 1:15 희석액으로 얼음처럼 차가운 균질화 완충액에서 균질화했습니다. 250μl 분취량 샘플 균질물을 28μl의 100% 트리클로로아세트산으로 침전시키고 얼음 위에서 30분간 배양한 다음 4,200g에서 5분간 원심분리했습니다. 이어서 pH 7.0의 1M Tris, 3M NaCl, 1% Tween 20을 함유한 Tris 완충액 15μl와 5.25M NaOH 30μl를 250μl 상층액에 첨가하여 pH를 ~9.0(8.97–9.03)으로 조정했습니다. 다음으로, 샘플을 60분 동안 14,000g에서 >3kDa 필터(Amicon Ultra-0.5ml; Millipore, Carrigtwohill, Ireland)로 여과했습니다. 그 사이에 다양한 표준(0–40 pmol/100μl)을 만들어 pH 9.0으로 조정했습니다. 100μl 샘플 또는 표준을 96웰 아민 결합 말레산 무수물 활성화 플레이트(Pierce; Thermo Fisher Scientific)에 두 번씩 첨가하고 4°C에서 밤새도록 흔들었습니다. 다음날, 플레이트를 1% Tween 20(pH 7.0의 PBST)이 포함된 PBS로 4번 세척하고, 1% BSA-PBST로 실온에서 45분 동안 블로킹했습니다. 100μl의 항-푸로마이신 항체(클론 12D10, 1:38,400)를 각 웰에 첨가하고 실온에서 105분 동안 배양했습니다. 이 배양 기간 후에 웰을 3번 세척했습니다. 다음으로, 호스래디시 퍼옥시다아제-접합 항-마우스 IgG Fc 2a(1:10,000; 밀리포어)를 각 웰에 첨가하고 실온에서 45분 동안 배양했습니다. 4번 더 세척한 후, Ultra 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB, Thermo Fisher)을 각 웰에 첨가하고 15분 동안 흔들었습니다. 그런 다음 0.16 M 황산(Thermo Fisher)으로 반응을 중단했습니다. 흡광도는 450nm 파장에서 플레이트 리더로 측정되었습니다. 자유 퓨로마이신의 농도는 표준 곡선에서 계산되었습니다.
통계 분석
웨스턴 블롯에서 얻은 데이터는 인슐린 자극 쥐 조직 표준 또는 항푸로마이신 주입 쥐 조직 표준에 대한 백분율 변화로 분석했습니다. 플라스마 분석에서 얻은 데이터와 웨스턴 블롯에서 얻은 데이터의 측정을 위해 혼합 모형 간-내부 설계에서 이원 분산 분석(ANOVA)(시간 x 치료)을 수행했습니다. 유의한 F 검정이 확인되면 LSD 사후 분석을 사용하여 평균 간 차이를 결정했습니다. p < 0.05인 차이는 통계적으로 유의한 것으로 간주했습니다. 모든 통계 분석은 IBM SPSS Statistics v19.0 소프트웨어(IBM Corporation, Armonk)를 사용하여 수행했으며 모든 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표현했습니다.
결과
현재 연구에서는 Western Blot 분석에서 퓨로마이신으로 표지된 펩타이드의 상대적 값이 근육 단백질 합성을 나타냈습니다.그림 1A). 이러한 상대값은 이미지(그림 1B)에서 푸로마이신 신호의 강도는 항푸로마이신 주입 쥐 조직 표준에 따라 정규화되었습니다. 자유 푸로마이신은 근육에 전달되어 신생 펩타이드 사슬에 통합되는 전구체입니다. 그룹 간에 자유 푸로마이신 수치에 유의한 차이는 없었습니다(그림 1C). MPS의 변화가 전구체 흡수의 차이로 인한 것일 가능성을 배제하기 위해 단백질 합성은 근육 내 자유 퓨로마이신 농도에 따라 정규화되었습니다.그림 1D). 결과는 운동(PLA)이 앉아서 하는 운동(SED)에 비해 운동 후 1시간에 MPS를 일시적으로 감소시켰음을 보여주었습니다(p = 0.08). 그러나 이러한 MPS 억제는 CP 치료에 의해 완전히 구제되었습니다(그림 1D). 또한 CP군은 운동 1시간 후 WP군보다 MPS가 더 높은 경향을 보였다(p=0.08)(그림 1D). 운동 후 2시간 동안 치료 간에 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다.그림 1D). (원시 데이터와 웨스턴 블롯 이미지 예시는 S1 파일 에서 이용 가능합니다 .)
MPS 및 MPB와 관련된 신호 전달 경로
mTOR 인산화는 운동 후 1시간과 2시간에 CP에 의해 SED에 비해 상당히 증가했습니다(p<0.05). mTOR 인산화는 또한 1시간에는 CP에서 PLA보다 높았고 2시간에는 WP보다 높았습니다.그림 2A). p70S6k 인산화는 운동 후 1시간에 CP에 의해 SED에 비해 상당히 증가했습니다. 2시간에 p70S6k 인산화는 CP에 의해 더욱 증가했지만 PLA 또는 WP의 인산화와 다르지 않았습니다(그림 2B). rpS6는 p70S6k의 하위 인자입니다. 운동은 운동 후 1시간과 2시간 모두에서 rpS6의 인산화를 상당히 증가시켰습니다(p<0.05). 세 운동 그룹 모두에서 rpS6 인산화 수준에 차이가 없었습니다(그림 2C). 4E-BP1의 인산화는 운동 후 1시간에 PLA에 의해 감소했습니다(p<0.05). WP와 CP는 이 감소를 1시간에 완전히 역전시켰고 SED와 비교하여 2시간에 4E-BP1의 인산화를 더욱 증가시켰습니다(p<0.05). PLA 그룹에서도 4E-BP1의 인산화는 2시간에 기저 수준으로 돌아왔습니다(그림 2D). (원시 데이터와 웨스턴 블롯 이미지 예시는 S1 파일 에서 제공됩니다 .)
Akt는 mTOR의 상류 기질이지만 Akt의 인산화는 mTOR와 동일한 인산화 패턴을 보이지 않았습니다. Akt 인산화는 운동 후 1시간 또는 2시간에 처리 간에 통계적으로 차이가 없었습니다(p>0.05)(그림 3A). GSK3는 Akt의 하류 기질입니다. GSK3α나 β는 그룹 간에 유의미한 차이를 보이지 않았습니다(그림 3B 및 3C). 마찬가지로 운동 후 1시간 또는 2시간에 그룹 간에 eIF2Bε 인산화의 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다.그림 3D). (원시 데이터와 웨스턴 블롯 이미지 예시는 S1 파일 에서 제공됩니다 .)
AMPKα는 에너지 감지 단백질입니다. RE 중 및 직후에 AMPKα의 활성화는 mTOR을 억제하여 MPS를 감소시키고 FOXO3A의 자극으로 부분적으로 MPB를 증가시킬 수 있습니다. 현재 연구에서 AMPKα와 FOXO3A의 인산화는 운동 후 1시간에 세 운동 그룹 모두에서 유의하게 증가했습니다(그림 4A 및 4B). AMPK의 인산화는 WP에서 2시간 동안 높은 수준을 유지했습니다(p<0.05)(그림 4A). FOXO3A의 인산화는 운동 후 2시간에 SED에 비해 CP에서 유의하게 증가했습니다(p<0.05)(그림 4B). (원시 데이터와 웨스턴 블롯 이미지 예시는 S1 파일 에서 제공됩니다 .)
혈장 내 포도당 수치와 호르몬 변화
운동 직후 그룹 간 혈장 포도당에 유의미한 차이는 없었습니다(p>0.05) (표 1). 운동 후 1시간에 CP의 혈장 포도당은 WP 그룹보다 높았습니다. 운동 후 2시간에 PLA와 WP 모두에서 혈장 포도당은 운동 직후에 비해 유의하게 감소했으며 이 수치는 CP보다 낮았습니다(p<0.05)(표 1). 운동 직후 그룹 간에 혈장 인슐린 수치에는 차이가 없었습니다(p>0.05). 그러나 혈장 인슐린은 운동 후 1시간에 CP 그룹에서 일시적으로 상승했습니다(p<0.05)(표 1). 혈장 GH는 운동 직후에 상당히 감소했지만 운동 후 1시간이나 2시간에는 그룹 간에 차이가 없었습니다.표 1). 혈장 IGF-1은 어떠한 시점에서도 처리에 따라 차이가 없었습니다.표 1). 혈장 코르티코스테론은 운동에 의해 상당히 증가했지만(p<0.05) 운동 후 1시간과 2시간에 기저 수준으로 돌아왔습니다.표 1). (원시 데이터는 S2 파일 에서 이용 가능합니다 .)
논의
RE는 주로 MPS를 자극하여 근육 단백질 축적을 유발할 수 있으며, 이 활성화는 단일 RE 발작 후 수 시간 동안 높은 수준을 유지할 수 있다는 것이 일반적으로 받아들여집니다[ 1 , 17 , 28 ]. 그러나 운동 회복의 짧은 기간 내에 MPS가 억제될 수 있으며[ 2 , 3 ] 순 단백질 균형은 공복 상태에서 음수로 유지됩니다[ 1-3 ] . 이는 기질 가용성이 부족하기 때문일 가능성이 높습니다. 따라서 운동 세션 간 간격이 매우 짧은 경우 효과적인 근육 회복 프로세스가 상당한 이점이 있을 수 있습니다. 이 연구의 주요 결과는 CHO와 WP의 공동 섭취가 초기 회복 단계에서 운동으로 인한 MPS 감소를 구제했으며 쥐의 FHL에서 mTOR 신호 전달 경로의 활성화와 관련이 있다는 것입니다.
운동 후 1시간에 보충제를 제공하지 않으면 MPS가 감소했습니다.이 발견은 쥐 지구력 운동 모델을 사용한 Anthony et al. [ 3 ]의 결과와 일치하지만, 저항 운동이 회복 첫 시간 동안 근육 단백질 합성을 증가시켰다는 여러 인간 연구와는 일치하지 않습니다 [ 1 , 29 , 30 ].쥐가 인간과 같은 방식으로 저항 운동에 반응하지 않을 가능성이 있습니다.이 반응 차이에 대한 또 다른 가능성은 사용된 운동 프로토콜에 있을 수 있습니다.현재 연구에서 쥐는 상체와 하체 근육을 사용하여 거의 지칠 때까지 사다리를 올랐습니다.그러나 운동 후 첫 시간 동안 MPS가 증가한 인간 연구에서 운동은 상지 근육에 국한되었습니다 [ 29 , 30 ].최근에 Macnaughton et al.은 전신 저항 운동 프로토콜 후 MPS를 극대화하려면 비교적 작은 근육량으로 저항 운동을 수행했을 때 이전에 발견된 것보다 더 많은 단백질 보충제가 필요하다는 것을 발견했습니다 [ 31 ]. 이는 큰 근육량이 강렬한 운동을 할 때 운동 후 아미노산 흡수가 더 큰 근육량에 분산되어 최대 효과를 얻기 위해 더 큰 단백질 보충제가 필요하다는 것을 시사합니다. 사다리 오르기와 같은 전신을 철저히 하는 운동은 기질 가용성을 고갈시켜 충분한 기질이 이용 가능할 때까지 근육 단백질 합성을 지연시키는 것과 같은 추가적인 결과를 초래할 수도 있습니다. 우리는 이 연구에 사용된 엄격한 전신 프로토콜이 기질 가용성을 고갈시키고 외인성 기질 의존성을 증가시켜 운동 후 MPS를 촉진하기보다는 오히려 약화시켰을 수 있다고 제안합니다. 그러나 설치류와 인간 사이에서 저항 운동에 대한 다른 급성 반응을 확인하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
관찰된 MPS 감소는 AMPK 활성화 증가와 4E-BP1 비활성화를 통해 매개된 것으로 보인다. 연구자들은 AMPK 활성화가 운동 중 MPS 억제와 운동 후 조기 회복 중 MPS 활성화 지연에 기여할 수 있다고 제안했다[ 29 , 32 ]. 본 연구에서 AMPK 인산화와 4E-BP1 억제는 SED 그룹에 비해 운동 후 1시간에 PLA에서 상당히 증가했다. 그러나 이 두 그룹 간의 차이는 운동 후 2시간에 사라졌다. 이러한 신호 단백질의 변화는 SED 그룹과 PLA 그룹을 비교했을 때 MPS의 변화와 유사한 패턴을 보였다.
운동 직후 보충제를 섭취했을 때, WP는 운동 후 1시간에 MPS를 완전히 회복하지 못했습니다. 그러나 CP 보충제는 운동 후 1시간에 PLA에 비해 MPS를 상당히 증가시켰다는 점은 주목할 만합니다. 게다가, CP에 따른 MPS는 운동 후 1시간에 SED 그룹과 WP 그룹보다 더 높은 경향을 보였습니다. MPS를 간접적으로 측정한 이전의 인간 연구에서, 운동 후 초기 3시간 동안 AA와 CHO의 독립적 효과와 결합 효과를 비교한 결과, AA와 CHO의 MPS에 대한 결합 효과는 대략 그 독립적 효과의 합과 같았다는 사실을 발견했습니다[ 10 ]. 근육 단백질 합성에 대한 직접적인 증거는 아니지만, 저희 연구실의 연구에 따르면 운동 후 CP 보충제는 CHO나 단백질을 개별적으로 섭취한 경우에 비해 동화 신호 전달 단백질의 활성화에 더 큰 효과가 있는 것으로 나타났습니다[ 8 , 9 ]. 운동 후 2시간에는 CP와 다른 치료군 간의 MPS에 차이가 없었습니다. 아마도 제공된 CP 양이 최적이 아니었거나, CP 보충제가 쥐의 MPS에 미치는 영향이 매우 빠르게 나타나서 나중에 추가 보충제를 공급하지 않는 한 회복 첫 시간 동안에만 나타나는 것일 수 있습니다.
일부 연구자들은 MPS에 대한 운동 후 단백질 보충제에 CHO를 추가하는 것의 유익한 효과를 찾지 못했다는 점에 유의해야 합니다.예를 들어, Koopman과 그의 동료들은 카제인과 다양한 용량의 CHO(0, 0.15, 0.6g/kg)를 RE 후 6시간에 전신 단백질 합성과 분해에 대해 비교했습니다[ 19 ].그들은 치료법 간에 단백질 합성이나 분해에 차이를 관찰하지 못했습니다.마찬가지로, Staples 등은 단일 다리 RE 프로토콜에서 회복한 후 처음 3시간 동안 WP 보충제에 CHO를 추가해도 MPS나 MPB에 더 이상 영향을 미칠 수 없다고 보고했습니다[ 20 ].연구 간의 불일치는 부분적으로 단백질 섭취 유형, 단백질 합성 측정 시기, 보충제 용량 및 동물 모델 선택 때문일 수 있습니다.그럼에도 불구하고, 우리의 결과는 보다 포괄적인 저항 운동 프로토콜에서 인간의 MPS에 대한 운동 후 단백질 보충제에 탄수화물을 추가하는 효과를 재평가하는 것이 신중할 수 있음을 시사합니다.
MPS 변화의 근본적 메커니즘과 관련하여 mTOR는 MPS 조절에 필수적인 키나제로 간주됩니다. mTOR가 활성화되면 하위 두 요소인 p70S6k와 4E-BP1을 추가로 인산화합니다[ 33 ]. p70S6k는 rpS6를 추가로 활성화할 수 있으며, 그러면 단백질 합성 용량이 증가합니다. 본 연구에서는 운동 직후에 CP를 제공했을 때 1시간에 SED 그룹보다 mTOR과 p70S6k의 인산화가 더 크게 증가했음을 보여주었습니다. 1시간에 CP에서 mTOR의 인산화도 PLA보다 높았고 WP보다 상당히 높았습니다. 운동 2시간 후에 CP에 대한 mTOR의 인산화는 SED와 WP보다 상당히 컸습니다. CP에서 p70S6K의 인산화는 운동 1시간과 2시간 후에 SED보다 상당히 증가했습니다. 이전 연구에 따르면 EAA+CHO 보충제는 위약보다 운동 후 더 큰 MPS를 자극했으며 이 MPS는 mTOR 및 p70S6k의 더 큰 인산화와 관련이 있었습니다[ 9 , 30 ]. 우리의 연구 결과와 이전 결과를 바탕으로 CP에 의해 자극된 증가된 MPS는 mTOR 신호 전달 경로의 활성화를 매개로 한다고 추측합니다. 그러나 현재 실험 설계에서는 mTOR 경로가 MPS에 미친 실제 영향을 결정할 수 없습니다.
또한 운동만으로 운동 후 1시간과 2시간 모두 rpS6가 인산화되었고, 이는 영양 보충에 의해 추가로 영향을 받지 않았다는 것을 발견했습니다. 이 결과는 다른 연구에서 근육 수축이 90kDa 리보솜 S6 키나제(p90 RSK )를 통해 rpS6를 직접 활성화할 수 있고 p70S6k에는 영향을 미치지 않는다는 강력한 증거를 제공했기 때문에 놀랍지 않았습니다[ 22, 34–36]. 반대로, 4E-BP1이 인산화되면 비활성화되고 mRNA가 40S 리보솜 서브유닛에 결합하는 것이 용이해집니다[33 ] . 이전 에 언급 했듯이 , 보충제를 제공하지 않으면 운동 후 1시간에 4E-BP1이 인산화되는 것이 상당히 억제되었지만, 운동 후 2시간에 인산화가 기저 수준으로 돌아왔습니다. 그러나 보충제를 제공했을 때, WP와 CP는 모두 운동 후 1시간에 PLA에 비해 4E-BP1의 더 높은 인산화를 유발했고, 운동 후 2시간에는 인산화 수준이 SED보다 더 높았습니다. 결과는 WP와 CP 보충제가 회복 첫 시간 동안 4E-BP1을 비활성화하고 몇 시간 동안 그 활동을 억제할 수 있음을 시사합니다.
Akt는 mTOR의 상류 기질입니다. Akt는 인산화이노시티드 3(PI3)-키나제 에 의한 인슐린 의존적 신호 전달 경로를 통해 인산화될 수 있습니다. 본 연구에서는 CP가 1시간에 혈장 인슐린 수치를 일시적으로 증가시킨 반면 Akt의 인산화는 어떤 처리에도 영향을 받지 않는다는 것을 발견했습니다. 이는 CP에 의한 mTOR의 활성화가 인슐린 신호 전달 경로를 통해 조절되지 않았음을 시사합니다. 그러나 Akt의 인산화와 활성화는 빠르고 매우 일시적일 수 있습니다. 따라서 운동 후 1시간이 되면 이 단백질의 인산화를 관찰하기에는 너무 늦었을 가능성이 있습니다. 글리코겐 합성효소 키나제(GSK) 3는 번역 개시의 또 다른 단계에 관여합니다. 인산화된 Akt와 p70S6k는 모두 GSK3α/β를 억제하여 eIF2Bɛ의 활성화를 유도할 수 있습니다[ 37 , 38 ]. 그러나 우리는 다양한 처리 또는 시간에 걸쳐 GSK3β, GSK3α 또는 eIF2Bɛ의 인산화 수준에서 어떠한 변화도 관찰하지 못했습니다.이러한 결과는 이전의 연구 결과와 일치합니다[ 35 , 39 ].이전 연구[ 39–41 ] 에 따르면 GSK3 - eIF2Bɛ 종속 신호 전달 경로에 의한 MPS 조절은 운동 회복의 후반 단계에서만 발생할 수 있습니다.따라서 우리의 결과는 회복의 초기 단계에서 영양 보충에 의해 조절되는 mTOR의 활성화와 4E-BP1의 억제가 GSK3-eIF2Bɛ 신호 전달 경로의 조절보다 MPS 자극에 더 중요한 역할을 한다는 것을 나타냅니다.
AMPK는 mTOR의 또 다른 상류 조절자입니다. 본 연구에서 AMPK의 인산화는 운동 후 1시간에 상당히 증가했습니다. 이 관찰은 운동만으로도 AMPK의 인산화를 증가시키고 mTOR을 억제하고 4E-BP1 인산화를 감소시켜 MPS를 감소시킬 수 있다는 것을 보여준 이전 연구에 의해 뒷받침됩니다[ 29 , 42 ]. 따라서 운동 후 1시간에 증가된 AMPK 인산화는 SED와 비교했을 때 PLA 및 WP 그룹에서 mTOR 인산화의 변화가 없고 MPS가 감소한 데 영향을 미칠 수 있습니다. 반면에 CP의 mTOR 인산화와 MPS는 운동 후 1시간에 상당히 증가했지만 AMPK 인산화도 증가했습니다. CP 보충제에 따른 혈장 인슐린 상승은 인슐린 신호 전달 경로를 통한 mTOR에 대한 AMPK의 억제제 효과를 무시한 것으로 추정됩니다. 혈장 인슐린 증가로 인해 근육 혈류와 근육 AA 수송이 증가하고 근육 AA 출력이 차단될 수도 있습니다[ 43 , 44 ]. 따라서 CP에 의한 MPS의 조기 향상은 AA 흡수, 특히 L-류신 흡수의 빠른 증가로 인해 발생했을 수 있으며, 이는 차례로 mTOR를 활성화했을 수 있습니다. 두 가설을 확인하려면 추가 연구가 필요합니다.
다른 성장 인자도 우리 연구에서 측정되었습니다. 혈장 GH는 운동 직후에 감소했지만, 모든 치료 그룹에서 운동 후 1시간과 2시간에는 차이가 관찰되지 않았습니다. 또한 운동이나 영양 보충이 IGF-1 혈장 수치에 영향을 미치는 것으로 관찰되었습니다. 따라서 CP 유도 MPS는 이러한 호르몬에 의해 제어되지 않았을 가능성이 큽니다.
MPB와 관련하여 FOXO3A는 두 가지 근육 특이적 E3 리가제인 근위축 F-박스(MAFbx 또는 atrogin1)와 근육 링핑거 단백질 1(MuRF1)의 발현을 조절하는 핵심 전사 인자입니다. 이러한 리가제는 근육 단백질 분해를 향상시키는 것으로 나타났습니다[ 45 ]. 본 연구에서 FOXO3A의 인산화는 운동 후 1시간에 세 운동 그룹 모두에서 상당히 증가했지만, CP 그룹에서만 운동 후 2시간에 SED 그룹에 비해 FOXO3A의 지속적인 인산화가 나타났습니다. Akt와 AMPK는 FOXO3A의 인산화를 매개하지만 MPB에 대한 제어는 반대입니다[ 46 , 47 ]. 저희 결과에 따르면 Akt는 시간과 치료에 따라 변화하지 않았고 AMPK의 인산화는 FOXO3A와 동일한 패턴을 따르지 않았습니다. 이러한 결과에 따르면 보충제는 운동 회복 초기 단계에서 MPB를 억제하지 않는 것으로 보입니다.
요약하자면, 단백질 보충제에 CHO를 첨가하면 쥐에서 PLA와 WP에 비해 운동 회복 초기의 MPS가 빨라집니다. MPS의 이러한 초기 향상은 혈장 인슐린의 증가로 인해 발생했을 수 있으며, 이는 차례로 mTOR 신호 전달 경로에 대한 AMPK의 억제 효과를 무효화했을 수 있습니다. 장기 회복 기간 동안 MPS와 MPB의 변화를 확인하기 위해 추가적인 시간 경과 연구가 필요합니다. 이 연구의 한계는 MPS의 변화를 평가하기 위해 퓨로마이신 절차를 사용하여 상대적인 총 단백질 변화만 감지할 수 있었다는 것입니다. 수축 단백질, 특히 근원섬유 단백질의 합성이 CP에 의해 증가되는지 여부는 아직 결정되지 않았습니다. 정확한 메커니즘은 알려지지 않았지만, 우리의 연구 결과에 따르면 CP는 저항 운동 직후 단백질 단독보다 더 효과적일 수 있습니다. 그러나 쥐와 인간 사이에서 운동과 보충제에 대한 반응에 차이가 있을 수 있으므로 결과를 해석할 때는 주의해야 합니다.
